富校軼，李博群，張時(shí)瑩，姚 磊

（國家大豆工程技術(shù)研究中心東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

超濾大豆蛋白肽對小鼠免疫功能的影響

富校軼，李博群，張時(shí)瑩，姚 磊*

（國家大豆工程技術(shù)研究中心東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

目的：研究超濾大豆蛋白肽對小鼠免疫功能的影響。方法：以正常小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，觀察不同劑量（0.85g/kg·bw、1.7g/kg·bw、5.1g/kg·bw）的超濾大豆蛋白肽對小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）、半數(shù)溶血值和碳粒廓清指數(shù)的影響。結(jié)果：與對照組（30.25±2.12）相比，高劑量組和中劑量組的超濾大豆蛋白肽半數(shù)溶血值水平[（51.08±8.33），（38.29±5.51）]顯著提高[（p<0.01），（p<0.05）]；與對照組（4.90±0.63）相比，高劑量組和中劑量組超濾大豆蛋白肽吞噬指數(shù)[（5.78±0.69），（5.62±0.57）]顯著提高（p<0.05）；但各劑量組動(dòng)物的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及足趾厚度差無顯著性差異（p>0.05）。結(jié)論：超濾大豆蛋白肽具有增強(qiáng)免疫功能中體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。

超濾大豆蛋白肽，免疫調(diào)節(jié)作用，半數(shù)溶血值，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

超濾大豆蛋白肽是一種大豆蛋白酶改性后又經(jīng)超濾膜分離富集后的大豆肽[1]。大豆肽是由3~6個(gè)氨基酸組成的低分子量肽。大豆肽的蛋白質(zhì)含量為85%左右[2]。大豆肽具有易消化吸收、能迅速供給機(jī)體能量、無蛋白變性、無豆腥味、液體粘性小和受熱不凝固等特性，在粘度、滲透壓、乳化性、溶解性等理化特性方面有優(yōu)勢[3]，大豆肽已成為大豆蛋白深加工的一個(gè)重要方向。近年來，研究表明，大豆肽有多種生物活性[4]如降低血清膽固醇、降血壓、增加免疫和促進(jìn)脂肪代謝等，其中，大豆肽在免疫活性方面的活性引起了關(guān)注。大豆肽能提高機(jī)體免疫力和抗病力，大豆肽對免疫反應(yīng)具有潛在的刺激作用[5]。但是目前的研究所采用的大豆肽樣品各異，未見超濾大豆蛋白肽的研究報(bào)道，并且，目前的報(bào)道都只是對免疫功能中細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫的某一項(xiàng)或二項(xiàng)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地考察了超濾大豆蛋白肽對小鼠免疫功能的影響，以期為超濾大豆蛋白肽的開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

昆明種健康雌性小鼠100只 購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)觀察3d，使動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。選擇健康雌性小鼠96只，體重18～24g，隨機(jī)分為8組，每組12只，隨機(jī)選擇4組52A8物作為免疫一組，余下的4組作為免疫二組。本次免疫的功能檢測選擇了全面反應(yīng)細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能的4項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，分別是遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、半數(shù)溶血值（HC50）測定實(shí)驗(yàn)、碳廓清實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物脾臟和胸腺指數(shù)測定實(shí)驗(yàn)，其中前兩個(gè)實(shí)驗(yàn)可以由同一批動(dòng)物來完成，稱為免疫一組；后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)由另一批動(dòng)物共同完成，稱為免疫二組；超濾大豆蛋白肽 大豆分離蛋白粉經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解（水解條件：溫度45℃，底物濃度5%，酶用量10000IU/g，反應(yīng)時(shí)間6h，反應(yīng)pH為7），蛋白水解液3000r/min離心5min，取上清液采用膜分離方法截取分子量為1000到3000之間的復(fù)合肽經(jīng)噴霧干燥成粉末，氮含量為14.3%；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、補(bǔ)體（豚鼠血清） 哈爾濱市海峽貿(mào)易有限公司；印度墨汁 北京市西中化工廠。

游標(biāo)卡尺（精密度0.01mm） 哈爾濱量具刃具廠；722-型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；潔凈工作臺(tái) 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 劑量設(shè)計(jì)

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6]，超濾大豆蛋白肽設(shè)三個(gè)劑量組，分別為0.85g/kg·bw（低劑量）、1.7g/kg·bw（中劑量）和5.1g/kg·bw（高劑量），同時(shí)設(shè)陰性對照組（蒸餾水）。各組動(dòng)物按體重的2%灌胃容積進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃30d后測各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫一組動(dòng)物進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）和半數(shù)溶血值測定的實(shí)驗(yàn)；免疫二組動(dòng)物進(jìn)行小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)以及脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測定的實(shí)驗(yàn)。1.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法） 將免疫一組動(dòng)物每只鼠經(jīng)腹腔注射2%（V/V，用生理鹽水配制）壓積SRBC（2000r/min，10min）0.2mL，致敏后4d，用游標(biāo)卡尺測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20%（V/V，用生理鹽水配制）壓積SRBC 20μL，于注射后24h測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。以注射SRBC后24h的足跖厚度減去注射前SRBC足跖厚度的差值（足跖腫脹度）來表示小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。

1.3.2 半數(shù)溶血值的測定 在上述遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)束的第2d，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋250倍，取1mL置試管內(nèi)，依次加入10%（V/V，用SA緩沖液配制）壓積SRBC 0.5mL，補(bǔ)體1mL（用SA緩沖液按1∶10稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以SA緩沖液代替），置37℃恒溫水浴中保溫30min后，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min，取上清液1mL、加都氏試劑3mL，同時(shí)取10%（V/V，用SA緩沖液配制）的壓積SRBC 0.25mL、加都氏試劑至4mL于另一試管中，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。半數(shù)溶血值（HC50）按下式計(jì)算：

樣品HC50＝樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值×稀釋倍數(shù)

1.3.3 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)[7]小鼠按0.1mL/10g體重尾靜脈注射1∶3.5倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。

注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并將其加到2mL Na2CO3溶液中。用722型分光光度計(jì)在600nm波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)α：

注：α是吞噬指數(shù)；t1為2min；t2為10min；OD1為2min時(shí)的樣品吸光度值；OD2為10min時(shí)的樣品吸光度值。

1.3.4 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定 將小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取肝臟、脾臟和胸腺去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。按公式計(jì)算動(dòng)物脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)（%）＝脾臟重量/體重×100%胸腺指數(shù)（%）＝胸腺重量/體重×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性的檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判定標(biāo)準(zhǔn)P=0.05。經(jīng)方差分析后，若各組均數(shù)不全相等，則用Dunnett-t進(jìn)行各組之間的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾大豆蛋白肽對小鼠體重的影響

給予超濾大豆蛋白肽30d后，小鼠體重的變化分別見表1和表2。

表1 超濾大豆蛋白肽對免疫一組小鼠體重的影響Table 1 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice body weight of the first immune group

表2 超濾大豆蛋白肽對免疫二組小鼠體重的影響Table 2 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice body weight of the second immune group

由表1和表2可知，與陰性對照組相比較，各免疫實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的初始體重和終末體重均無顯著性差異（p>0.05），說明本實(shí)驗(yàn)條件下超濾大豆蛋白肽對小鼠體重增長無影響。

2.2 超濾大豆蛋白肽對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

小鼠給予超濾大豆蛋白肽30d后，對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響見表3。

表3 超濾大豆蛋白肽對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 3 Effect of ultrafiltration soybean peptide on spleen index and thymus index

由表3可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的超濾大豆蛋白肽30d，與陰性對照組比較，各劑量組動(dòng)物的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均無顯著性差異（p>0.05）。說明超濾大豆蛋白肽對免疫器官脾臟和胸腺的總重量沒有影響。

2.3 超濾大豆蛋白肽對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）的影響

小鼠給予超濾大豆蛋白肽30d后對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）的影響見表4。

表4 超濾大豆蛋白肽對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）的影響Table 4 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice late onset allergy（foot palm thickening method）

由表4可見，與陰性對照組相比較，初始足跖厚度無顯著性差異（p>0.05），經(jīng)口給予小鼠不同劑量的超濾大豆蛋白肽30d，與陰性對照組相比較，各劑量組動(dòng)物足趾厚度差無顯著性差異（p>0.05），即超濾大豆蛋白肽不能夠增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

2.4 超濾大豆蛋白肽對小鼠半數(shù)溶血值 （HC50）的影響

小鼠給予超濾大豆蛋白肽30d后對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響見表5。

表5 超濾大豆蛋白肽對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響Table 5 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice hemolysis half value（HC50）

由表5可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的超濾大豆蛋白肽30d，與陰性對照組比較，中劑量組動(dòng)物半數(shù)溶血值顯著升高（p<0.05），高劑量組動(dòng)物半數(shù)溶血值顯著升高（p<0.01），表明超濾大豆蛋白肽能提高小鼠半數(shù)溶血值，反應(yīng)出超濾大豆蛋白肽增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。

2.5 超濾大豆蛋白肽對小鼠碳廓清功能的影響

給予超濾大豆蛋白肽30d后對小鼠碳廓清能力的影響見表6。

表6 超濾大豆蛋白肽對小鼠碳廓清功能的影響Table 6 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice carbon clearance function

由表6可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的超濾大豆蛋白肽30d，與陰性對照組比較，中劑量組和高劑量組吞噬指數(shù)顯著增加（p<0.05），說明超濾大豆蛋白肽可以增加小鼠碳廓清功能，反應(yīng)出超濾大豆蛋白肽增強(qiáng)機(jī)體的單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。

3 討論

免疫功能分為細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和非特異性免疫功能3類。其中，非特異性免疫功能包括單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和免疫器官的比值等。本研究選擇了3類免疫功能的代表性實(shí)驗(yàn)，即反映體液免疫功能的半數(shù)溶血值（HC50）的測定、反映單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、反映細(xì)胞免疫功能的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）以及反映免疫器官的比值的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，觀察經(jīng)口給予不同劑量超濾大豆蛋白肽30d對小鼠各種免疫功能的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中劑量組超濾大豆蛋白肽半數(shù)溶血值顯著高于對照組水平，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明超濾大豆蛋白肽可增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能，該結(jié)果與國明明等[8]的研究結(jié)果一致。Tsuruki T等研究發(fā)現(xiàn)大豆中的免疫刺激肽可以提高人嗜中性白細(xì)胞的吞噬功能[9]，本研究中，高、中劑量組超濾大豆蛋白肽吞噬指數(shù)顯著高于對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明超濾大豆蛋白肽可增強(qiáng)小鼠的碳廓清功能，即單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能；潘翠玲等研究表明，添喂大豆蛋白酶解物的仔豬胸腺、脾臟的絕對和相對質(zhì)量均有大幅提高[10]。有研究報(bào)道，大豆多肽液提高脾臟指數(shù)[11]。但是，在本研究中未見超濾大豆蛋白肽增加脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，可能是與本實(shí)驗(yàn)選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)樣品不同有關(guān)。

國明明等[8]的研究還發(fā)現(xiàn)大豆肽可以提高細(xì)胞免疫功能，但本研究各劑量組動(dòng)物足趾厚度差無顯著性差異，表明超濾大豆蛋白肽對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)無影響。這可能與所選擇細(xì)胞免疫功能的檢測實(shí)驗(yàn)不同有關(guān)，因此，對于大豆肽的細(xì)胞免疫功能還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)超濾大豆蛋白肽具有增強(qiáng)免疫功能中的體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。

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Effect of ultrafiltration soybean peptide on immune function of mice

FU Xiao-yi，LI Bo-qun，ZHANG Shi-ying，YAO Lei*
（National Research Soybean Engineering and Technology Center Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Objective：To study the effect of ultrafiltration soybean peptide on immune-related functions in mice. Methods：The normal mice were chosen as experimental object in order to observe the effect of different doses（0.85g/kg，1.7g/kg，5.1g/kg）of ultrafiltration soybean protein peptide on spleen index，thymus index，late onset allergy（foot palm thickening method），half hemolysis value and carbon particles clear index in mice.Results：Compared with the control group，the half hemolysis value of high dose and moderate dose of ultrafiltration soybean protein peptide were higher significantly[（51.08±8.33），（38.29±5.51）][（p＜0.01），（p＜0.05）]；the devour index of high dose and moderate dose of ultrafiltration soybean protein peptide were higher significantly[（5.78± 0.69），（5.62±0.57）]（p＜0.05）.However，there were no significant differences among four groups in the aspect of the spleen index，the thymus index and late onset allergy（foot palm thickening method）（p＞0.05）.Conclusion：ultrafiltration soybean protein peptide can strengthen humoral immune function and mononuclear-macrophage phagocytosis function.

ultrafiltration soybean protein peptide；immune-adjustment function；half hemolysis value；late onset allergy

TS201.4

A

1002-0306（2012）07-0375-04

2011－03－18 *通訊聯(lián)系人

富校軼（1971-），女，高級工程師，研究方向：大豆精深加工技術(shù)研究。

黑龍江省國際合作課題。