尹 鵬，魏寶東

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

雙重抗性篩選輔酶Q10高產(chǎn)菌株

尹 鵬，魏寶東*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

以米曲霉（Aspergillus oryzae）Asp11為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變處理，以制霉菌素和維生素K3雙抗性為篩選標(biāo)記，獲得制霉菌素抗性突變株Asp11-N006和制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株Asp11-N006-V01，其合成輔酶Q10的能力較出發(fā)菌株顯著提高。Asp11-N006和Asp11-N006-V01的輔酶Q10產(chǎn)量分別為28.27mg/L和38.46mg/L，較出發(fā)菌株分別提高了0.34倍和0.82倍，且遺傳性狀穩(wěn)定。

米曲霉，輔酶Q10，誘變，抗性篩選

輔酶Q10是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，又稱泛醌、癸烯醌，它是呼吸鏈中NADH脫氫酶、Ain酸脫氫酶和維生素B-C復(fù)合物之間的脂溶性電子載體，是細(xì)胞能量代謝的生成要素[1-2]。作為與能量轉(zhuǎn)換有關(guān)的若干酶系統(tǒng)的輔助因子之一，它不僅是呼吸鏈上的氧化還原成分，更是生成ATP的必需輔酶[3]。輔酶Q10可與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合，在呼吸鏈中起載體作用；另外，因其醌式及側(cè)鏈異戊烯基結(jié)構(gòu)等特點，還是重要遞氫體和細(xì)胞能量生成要素，并具有抗氧化和控制細(xì)胞內(nèi)氧氣流動等性能，在生命體中發(fā)揮著重要的生理功能[4]。它不僅是細(xì)胞自身天然的抗氧化劑、細(xì)胞代謝的促進(jìn)劑和呼吸的激活劑，對清除自由基及穩(wěn)定生物膜功能有著重要作用，還具有增強人體免疫功能、預(yù)防心臟病、保護(hù)肝臟和抗癌等作用[5]。因此，輔酶Q10在用于臨床治療疾病、提高免疫力和延緩人體衰老等方面有著不可代替的作用[6]。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10是最具發(fā)展前途的生產(chǎn)方式。但是，有很多因素制約著發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)，而導(dǎo)致產(chǎn)量相對較低。其中，高產(chǎn)菌株的選育是目前發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10的研究關(guān)鍵。本實驗從篩選輔酶Q10高產(chǎn)菌株出發(fā)，以米曲霉為出發(fā)菌株，定向篩選得到抗性突變株，以期能有所突破，提高輔酶Q10產(chǎn)量。米曲霉作為發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的新菌種，在國內(nèi)外尚未見到相關(guān)報道。因此，通過本研究，以期為工業(yè)化生產(chǎn)輔酶Q10提供新的實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae） 本院實驗室保存；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（新鮮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH自然）；發(fā)酵培養(yǎng)基（%） 葡萄糖2.5、蔗糖2.5、蛋白胨1、酵母浸粉2、KH2PO40.1、K2HPO40.05、MgSO40.05，pH6.5；抗性培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基，分別加入一定量的制霉菌素和維生素K3；輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品 北京夏斯生物技術(shù)有限公司；制霉菌素、維生素K3美國Genview；其他試劑 均為分析純和生化試劑。

PB-10 pH計 Sartorius Co.Ltd；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 北京沃德電子實驗設(shè)備廠；CT14RD臺式高速冷凍離心機 上海天美科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 取一支新鮮培養(yǎng)至孢子成熟的出發(fā)菌株試管斜面，加入5mL去離子水，輕輕振蕩試管，洗下斜面上的孢子，轉(zhuǎn)移至裝有10mL無菌水的三角瓶（內(nèi)含玻璃珠）中，再加入5mL去離子水沖洗斜面，并一同轉(zhuǎn)入三角瓶，然后搖床振蕩30min以充分打散孢子團，最后通過血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子懸液的濃度為107個/mL。

1.2.2 制霉菌素和維生素K3最小抑制濃度的確定 在PDA培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取0.2mL出發(fā)菌株制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況。

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，將誘變得到的抗性菌株Asp11－N006制備孢子懸液，取0.2mL涂布于該抗性平板上，確定最小抑制濃度。在確定該濃度之后，在PDA培養(yǎng)基中添加該濃度的制霉菌素，同時添加質(zhì)量濃度為320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的維生素K3制成抗性平板，取0.2mL抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該平板，同時以未加維生素K3的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況。

1.2.3 紫外誘變 將20W的紫外燈開啟預(yù)熱20min，取5mL制備的孢子懸液于9cm的無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下垂直距離30cm處邊磁力攪拌邊照射，照射時間為5min，然后在紅燈下吸取1mL紫外照射的孢子懸液適當(dāng)稀釋，涂布平板進(jìn)行抗性篩選，同時以未經(jīng)照射的空白組為平行對照。

1.2.4 平板初篩 將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋涂布于抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取菌落生長快、孢子數(shù)量多的單菌落轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)后冷藏保藏，以備進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩。

1.2.5 搖瓶復(fù)篩 將初篩得到的抗性菌株按1.2.1的方法制備孢子懸液，調(diào)整濃度為109個/mL，然后按12%的接種量，直接將孢子懸液接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72h。離心收集菌體，測定輔酶Q10產(chǎn)量。

1.2.6 產(chǎn)物分離測定 利用堿醇皂化法[7]從菌體中提取輔酶Q10。采用薄層層析（TLC）分離濃縮發(fā)酵液中的輔酶Q10，并用紫外分光光度法[8]測定發(fā)酵液中輔酶Q10的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉產(chǎn)輔酶Q10的確定

米曲霉為好氧型真菌，是重要且安全的工業(yè)發(fā)酵菌株[9]。將米曲霉作為出發(fā)菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，對其菌體的萃取液進(jìn)行濃縮，并定容于1mL無水乙醇中進(jìn)行薄層層析分離，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，出發(fā)菌株粗提品經(jīng)TLC（薄層層析）分離，在與輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品色帶相同的Rf值處，也分離出了色帶，刮下標(biāo)準(zhǔn)品色帶和出發(fā)菌株粗提品色帶，分別定容于3mL無水乙醇中，在190～330nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，出發(fā)菌株粗提品的紫外吸收峰型和輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰型相一致，這說明米曲霉能合成輔酶Q10，其出發(fā)菌株的產(chǎn)量為21.09mg/L。

圖1 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品與出發(fā)菌株粗提品的薄層層析圖Fig.1 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and the starting strains crude products

圖2 出發(fā)菌株粗提品的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of starting strain crude products

2.2 制霉菌素抗性突變株的篩選

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取出發(fā)菌株制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長情況，見表1。

表1 制霉菌素對菌體生長的影響Table 1 Effect of nystatin on cell growth

通過表1可以確定制霉菌素的最小抑制濃度為130μg/mL，并以此濃度作為抗性篩選標(biāo)記。出發(fā)菌株Asp11的孢子懸液經(jīng)紫外誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂布于含制霉菌素濃度130μg/mL的抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取生長良好的單菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面。再經(jīng)搖瓶復(fù)篩，得到8株產(chǎn)量高于出發(fā)菌株25%的制霉菌素抗性菌株，見表2。其中，抗性菌株Asp11－N006的產(chǎn)量提高幅度最大，輔酶Q10產(chǎn)量為28.27mg/L，較出發(fā)菌株提高了0.34倍。再對該抗性菌株連續(xù)傳代十次，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實驗。結(jié)果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，各代菌株輔酶Q10產(chǎn)量從28.27mg/L到27.06mg/L，產(chǎn)量無明顯減少，說明該突變株的性狀能穩(wěn)定遺傳。

表2 抗性菌株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 2 The production of coenzyme Q10from resistant strains

結(jié)果表明，選育制霉菌素抗性突變株，可以在一定程度上提高輔酶Q10產(chǎn)量。推測原因，制霉菌素作為一種大環(huán)內(nèi)酯類真菌抑制劑，能和真菌細(xì)胞膜中的麥角固醇結(jié)合，引起細(xì)胞膜損傷，從而使細(xì)胞膜的通透性增加?？赡苡捎谥泼咕乜剐酝蛔冎甑募?xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而增加了菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有利于進(jìn)一步合成輔酶Q10。

2.3 制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株的篩選

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取上述誘變得到的抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況，確定制霉菌素的最小抑制濃度，見表3。

在確定該濃度之后，在PDA培養(yǎng)基中添加該濃度的制霉菌素，同時添加質(zhì)量濃度為320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的維生素K3制成雙重抗性平板，取抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該平板，同時以未加維生素K3的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況，見表3。

表3 維生素K3對菌體生長的影響Table 3 Effect of Vitamin K3on strain growth

通過表3可以確定制霉菌素的最小抑制濃度為150μg/mL、維生素K3的最小抑制濃度為420μg/mL，并以此濃度作為抗性篩選標(biāo)記。將抗性菌株Asp11－ N006的孢子懸液進(jìn)行紫外誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂布于含制霉菌素濃度150μg/mL和維生素K3濃度420μg/mL的抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取生長良好、孢子數(shù)量多的單菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面。再經(jīng)搖瓶復(fù)篩，得到5株產(chǎn)量高于出發(fā)菌株50%的制霉菌素及維生素K3雙重抗性菌株，其中，抗性菌株Asp11－N006－V01的產(chǎn)量提高幅度最大，輔酶Q10產(chǎn)量為38.46mg/L，較抗性菌株Asp11－N006提高了0.36倍，較出發(fā)菌株提高了0.82倍。再對該抗性菌株連續(xù)傳代十次，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實驗。結(jié)果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，各代菌株輔酶Q10產(chǎn)量從38.46mg/L到37.23mg/L，產(chǎn)量無明顯減少，說明該突變株的性狀能穩(wěn)定遺傳。

結(jié)果表明，以制霉菌素抗性突變株為出發(fā)菌株，進(jìn)一步篩選得到制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株，有利于進(jìn)一步提高輔酶Q10產(chǎn)量。在輔酶Q10合成過程中可能存在終產(chǎn)物抑制，篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株可從遺傳角度解除微生物的正常代謝調(diào)控，有利于目的產(chǎn)物的合成。維生素K3是輔酶Q10的結(jié)構(gòu)類似物，篩選出的突變株對維生素K3的耐受濃度提高，可能部分解除了終產(chǎn)物對參與輔酶Q10生物合成的有關(guān)酶的反饋抑制，從而提高了輔酶Q10的生物合成量。

2.4 抗性菌株產(chǎn)輔酶Q10的分離測定

圖3 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品與抗性菌株粗提品的薄層層析圖Fig.3 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and resistant strains crude products

圖4 抗性菌株粗體品的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of resistant strain crude products

將上述篩選得到的抗性菌株Asp11－N006和Asp11－N006－V01進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，采用堿醇皂化法提取菌體中的輔酶Q10，將所得粗提品定容至1mL無水乙醇中，進(jìn)行薄層層析分離（見圖3），定性測定輔酶Q10產(chǎn)量，并用紫外分光光度法定量測定發(fā)酵液中輔酶Q10的產(chǎn)量，結(jié)果見圖4和表4。

表4 抗性菌株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 4 The production of coenzyme Q10from resistant strains

3 結(jié)論

3.1 米曲霉為好氧型微生物，通過TLC（薄層層析分離）說明，在其生長代謝過程中能夠合成輔酶Q10。

3.2 本實驗選取了兩個抗性篩選標(biāo)記，通過紫外誘變選育到制霉菌素抗性突變株Asp11-N006和制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株Asp11-N006-V01，對該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其輔酶Q10產(chǎn)量分別為28.27mg/L和38.46mg/L。相較出發(fā)菌株而言，產(chǎn)輔酶Q10能力分別提高了0.34倍和0.82倍，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]薛茂云.輔酶Q10的營養(yǎng)作用及應(yīng)用[J].江蘇調(diào)味副食品，2010，27（1）：13-16.

[2]張惠展.途徑工程[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

[3]石若夫，熊璐璐.產(chǎn)輔酶Q10熱帶假絲酵母菌株C-1發(fā)酵過程優(yōu)化[J].南京理工大學(xué)學(xué)報，2008，32（5）：651-654.

[4]許芳，張淑榮，張鵬.酶解和凍融輔助超聲提取光合細(xì)菌中輔酶Q10的研究[J].化學(xué)與生物工程，2008（8）：43-45.

[5]KelsoGF，PorteousCM，HughesG.Prevention of mitochondrial oxidative damage using targeted antioxidants[J].AnnN YAcad Sci，2002，959：263.

[6]孟妤，單志萍.三孢布拉氏霉菌體中輔酶Q10測定方法的條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2009，30（9）：162-164.

[7]張延靜，袁其朋，梁浩.產(chǎn)輔酶Q10酵母的發(fā)酵條件研究[J].微生物學(xué)通報，2003，30（2）：65-69.

[8]柴瑞震，姜仕華，蔣順國，等.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范與藥品質(zhì)控工作法規(guī)全書[M].成都：成都科技大學(xué)出版社，1995：620.

[9]劉川順，李平，李健.谷氨酰胺合成酶產(chǎn)酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010（7）：4-7.

Screening coenzyme Q10high-yielding strain with double resistance screening label

YIN Peng，WEI Bao-dong*
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Aspergillus oryzae（Asp11）was used as the starting strain，through UV mutagenesis，obtained resistant mutants Asp11-N006 and Asp11-N006-V01 with double resistance of Nystatin and vitamin K3as screening label，and production of coenzyme Q10performance marked higher than the starting strain.The production of coenzyme Q10reached to 28.27mg/L and 38.46mg/L，improved into 0.34 times and 0.82 times by comparing with the starting strain.The mutant strains had stable genetic traits.

Aspergillus oryzae；coenzyme Q10；mutagenesis；resistance screening

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0150-04

2011－06－01 *通訊聯(lián)系人

尹鵬（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。