趙玉紅，張 睿，潘 強(qiáng)

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

鹿茸醇提物對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

趙玉紅，張 睿，潘 強(qiáng)

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

目的:研究鹿茸醇提物(AVAE)對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法:156只昆明種雄性小鼠分成空白組(12只小鼠，灌胃生理鹽水)、記憶獲取階段組、記憶鞏固階段組和記憶再現(xiàn)階段組(每組48只小鼠)，各階段組中的高、中、低劑量組每天每只小鼠分別灌胃鹿茸乙醇提取物的干粉量為1kg/(kg·d)、0.5kg/(kg·d)和0.1kg/(kg·d)。灌胃30d，測定各個記憶階段小鼠跳臺實驗的潛伏期及錯誤次數(shù)、水迷宮實驗的游出時間及錯誤次數(shù)和小鼠大腦內(nèi)的SOD酶活力及MDA含量。結(jié)果:鹿茸醇提物能明顯延長各個階段小鼠跳臺實驗的潛伏期(P＜0.01)并減少錯誤次數(shù)(P＜0.01);縮短小鼠水迷宮實驗的游出時間及減少錯誤次數(shù)(P＜0.01，P＜0.05);提高小鼠腦內(nèi)SOD酶活力(P＜0.01，P＜0.05);降低小鼠腦內(nèi)MDA含量(p＜0.01，p＜0.05)。結(jié)論:鹿茸醇提物對小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。

鹿茸醇提物，學(xué)習(xí)記憶，跳臺實驗，水迷宮實驗

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 由哈爾濱腫瘤醫(yī)院提供，雄性，體重(20±2)g;鹿茸醇提物 冷凍鮮茸切塊、凍干、粉碎，過40目篩，用80%乙醇，料液比1∶50，常溫浸提3d，浸提物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，濃縮物根據(jù)不同劑量組的用量加水稀釋到特定濃度;無水乙醇、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。0.05)。

TGL－16G臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠; T6型紫外/可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ALPHA1－2冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司;LW－Ⅱ水迷宮、跳臺儀 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

表1 跳臺法測定鹿茸醇提物對小鼠記憶獲取、鞏固、再現(xiàn)障礙的影響(ˉx±s，n=12)Table 1 Effect of AVAE on memory obtain，consolidate and reappearance impairment mice by jumping platform experiment(ˉx±s，n=12)

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 156只昆明種雄性小鼠，按體重平均分成13組，即空白組(灌胃生理鹽水);記憶獲取階段高、中、低劑量組(用鹿茸乙醇提取物干粉量分別為1、0.5和0.1kg/(kg·d)，灌胃)和模型組(實驗前腹腔注射戊巴比妥鈉15mg/kg);記憶鞏固階段高、中、低劑量組(用鹿茸乙醇提取物的干粉量分別為1、0.5和0.1kg/(kg·d)灌胃)和模型組(實驗前腹腔注射亞硝酸鈉120mg/kg);記憶再現(xiàn)階段高、中、低劑量組(用鹿茸乙醇提取物的干粉量分別為1、0.5和0.1kg/(kg·d)灌胃)和模型組(實驗前灌胃30%乙醇10mL/kg)，每組12只，連續(xù)灌胃30d。

1.2.2 跳臺實驗測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 實驗裝置為一長方形反射箱，分為2間，底面輔以間距為0.5cm銅柵。每間左右角置一高和直徑均為4.5cm的絕緣臺。實驗分訓(xùn)練和測驗兩個部分(記憶獲取階段不需要訓(xùn)練)。訓(xùn)練階段:第29d給藥后用跳臺儀訓(xùn)練，訓(xùn)練時先將小鼠放入反射箱內(nèi)適應(yīng)3min，然后立即通以40V交流電，令小鼠產(chǎn)生記憶。實驗階段:第30d給藥后30min，記憶獲取階段動物除空白組外均腹腔注射戊巴比妥鈉15mg/kg形成記憶獲取障礙［13］;記憶鞏固階段動物除空白組外均腹腔注射亞硝酸鈉120mg/kg［14］形成記憶鞏固障礙;記憶再現(xiàn)階段動物除空白組外均灌胃30%乙醇10mL/kg bw形成記憶再現(xiàn)障礙。實驗時將小鼠放入跳臺裝置適應(yīng)3min，通以40V交流電，小鼠受到電擊后跳回平臺以躲避電擊為正確反應(yīng)，如再次跳到銅柵上受到電擊，即為錯誤反應(yīng)，記錄5min內(nèi)的錯誤次數(shù)和潛伏期，作為小鼠的學(xué)習(xí)成績［11］。

1.2.3 水迷宮實驗測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 實驗裝置為一長1.1m×0.7m×0.3m的玻璃槽，槽的一端有階梯，動物可順其爬上，槽內(nèi)為迷宮狀，多處有盲端，只有一條可達(dá)到階梯，實驗時槽內(nèi)充水，水深9cm，水溫(30±2)℃。水迷宮實驗分訓(xùn)練和測驗兩個部分。訓(xùn)練階段:從給藥第25d開始，對各組小鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，其中記憶獲取階段小鼠除空白組外每天要在灌胃后腹腔注射戊巴比妥鈉15mg/kg形成記憶獲取障礙后再進(jìn)行訓(xùn)練，到第29d時，所有小鼠可以自行游出水迷宮。實驗階段:第30d給藥后30min，記憶獲取階段動物除空白組外均腹腔注射戊巴比妥鈉15mg/kg形成記憶獲取障礙;記憶鞏固階段動物除空白組外均腹腔注射亞硝酸鈉120mg/kg形成記憶鞏固障礙;記憶再現(xiàn)階段動物除空白組外均灌胃30%乙醇10mL/kg bw形成記憶再現(xiàn)障礙。實驗時將小鼠從水迷宮長臂端輕輕放入水中，其在110s內(nèi)直接到達(dá)平臺為正確反應(yīng)，以每組平均錯誤次數(shù)和抵達(dá)平臺所需時間作為小鼠的學(xué)習(xí)成績［13］。

1.2.4 小鼠腦組織中SOD酶活力和MDA含量的測定 取進(jìn)行過跳臺和水迷宮實驗的記憶再現(xiàn)組高、中、低劑量組的小鼠和空白組小鼠，脫臼處死，于冰浴上開顱取腦組織，按照試劑盒上的說明，測定各組小鼠SOD酶活力和MDA含量。

1.2.5 統(tǒng)計方法 各項指標(biāo)均采用Minitab15軟件統(tǒng)計，并進(jìn)行方差分析，實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 跳臺實驗測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

戊巴比妥鈉有催眠和麻醉的作用，腹腔注射可形成記憶獲取障礙;亞硝酸鈉可麻痹血管運(yùn)動中樞、呼吸中樞及周圍血管，形成高鐵血紅蛋白，高鐵血紅蛋白不能攜氧和可逆性地釋放氧，使原來可與氧結(jié)合的鐵離子部位都失去電子，與羥基或氯化物牢固地結(jié)合，導(dǎo)致大腦缺氧，形成記憶鞏固障礙;乙醇為中樞抑制劑，灌胃較低濃度即可明顯破壞記憶過程，形成記憶再現(xiàn)障礙。采用1.2.2方法可以得到如表1。

表1顯示，對于記憶獲取實驗，模型組與空白組相比，潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶獲取障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，潛伏期均有所延長，錯誤次數(shù)均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，各劑量組的兩項指標(biāo)與模型組相比都有極顯著差異(P＜0.01)，各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。高劑量組作用效果較差可能是由于灌胃的提取物濃度較高，對學(xué)習(xí)記憶能力有一定的抑制作用。

對于記憶鞏固實驗，模型組與空白組相比，潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶鞏固障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，潛伏期均有所延長，錯誤次數(shù)均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，中、低劑量組的兩項指標(biāo)與模型組相比都有極顯著差異(P＜0.01)，高劑量組模型組相比，潛伏期有極顯著差異(P＜0.01)，錯誤次數(shù)有顯著差異(P＜0.05)，各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

表2 水迷宮法測定鹿茸醇提物對小鼠記憶獲取、鞏固、再現(xiàn)障礙的影響(ˉx±s，n=12)Table 2 Effect of AVAE on memory obtain，consolidate and reappearance impairment mice by water maze experiment(ˉx±s，n=12)

對于記憶再現(xiàn)實驗，模型組與空白組相比，潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶再現(xiàn)障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，潛伏期均有所延長，錯誤次數(shù)均有所降低，經(jīng)統(tǒng)計分析，中劑量組的兩項指標(biāo)與模型組相比都有極顯著差異(P＜0.01)，低、高劑量組與模型組相比，潛伏期有極顯著差異(P＜0.01)，錯誤次數(shù)有顯著差異(P＜0.05)，各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

2.2 水迷宮實驗測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

表2顯示，對于記憶獲取實驗，模型組與空白組相比，小鼠游出水迷宮的時間明顯延長，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶獲取障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，游出水迷宮的時間均有所縮短，錯誤次數(shù)均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，中劑量組兩項指標(biāo)與模型組相比有極顯著差異(P＜0.01);低劑量組與模型組相比，游出水迷宮時間有顯著差異(P＜0.05)，而錯誤次數(shù)有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組的兩項指標(biāo)與模型組相比均有顯著差異(P＜0.05)。由各劑量組與模型組數(shù)值差異的大小可得出結(jié)論:各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

對于記憶鞏固實驗，模型組與空白組相比，小鼠游出水迷宮的時間明顯延長，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶鞏固障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，游出水迷宮的時間均有所縮短，錯誤次數(shù)均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，中、低劑量組的兩項指標(biāo)與模型組相比有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組與模型組相比，游出水迷宮時間有顯著差異(P＜0.05)，而錯誤次數(shù)有極顯著差異(P＜0.01);由各劑量組與模型組數(shù)值差異的大小可得出結(jié)論:各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

對于記憶再現(xiàn)實驗，模型組與空白組相比，小鼠游出水迷宮的時間明顯延長，錯誤次數(shù)明顯增多，證明記憶再現(xiàn)障礙模型建模成功。各劑量組與模型組相比，游出水迷宮的時間均有所縮短，錯誤次數(shù)均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，中劑量組兩項指標(biāo)與模型組相比有極顯著差異(P＜0.01);低劑量組與模型組相比，游出水迷宮時間差異不顯著，但錯誤次數(shù)有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組與模型組相比，游出水迷宮時間差異也不顯著，但錯誤次數(shù)有顯著差異(P＜0.05)。由各劑量組與模型組數(shù)值差異的大小可得出結(jié)論:各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

2.3 鹿茸醇提物對小鼠腦中SOD活力和MDA含量的影響

自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究表明:自由基可以直接攻擊DNA，造成其永久性損傷;可以攻擊生物膜的不飽和脂肪酸引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng);可以攻擊蛋白質(zhì)引起其結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的改變，造成肽鏈斷裂、聚合與交聯(lián);所有這些生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的改變，必然會導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，從而導(dǎo)致很多疾病［15］。SOD是一種重要的抗氧化劑，它可以使細(xì)胞免受超氧陰離子自由基的攻擊，保護(hù)腦細(xì)胞和腦組織［16］，其活力越高說明學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過氧化水平，同時間接反映自由基損傷程度，是衡量腦缺血損傷的重要指標(biāo)［17］。采用1.2.4法可以得到如表3。

表3 鹿茸醇提物對小鼠腦中SOD活力和MDA含量的影響(ˉx±s，n=12)Table 3 Effect of AVAE on SOD activity and MDA content of brain in mice(ˉx±s，n=12)

表3顯示，各劑量組與空白組相比，小鼠腦內(nèi)SOD活力均有所增強(qiáng)，MDA含量均有所降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，中劑量組與空白組相比，小鼠腦內(nèi)SOD活力和MDA含量均有極顯著差異(P＜0.01);低劑量組與空白組相比，均有顯著差異(P＜0.05);高劑量組與空白組相比，差異均不顯著。由各劑量組與空白組數(shù)值差異的大小可得出結(jié)論:各劑量組的作用效果由強(qiáng)到弱依次為中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。

3 結(jié)論

鹿茸醇提物對小鼠記憶獲取、記憶鞏固、記憶再現(xiàn)三個階段的記憶障礙均有明顯的改善作用，有助于拮抗超氧陰離子自由基的攻擊，保護(hù)SOD的活力，抑制脂質(zhì)過氧化作用，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，能夠有效提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

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Effect of antler velvet alcohol extracts on improving learning and memory sbilities in mice

ZHAO Yu－h(huán)ong，ZHANG Rui，PAN Qiang
(School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of antler velvet alcohol extract(AVAE)on learning and memory in mice.Methods:One hundred and fifty－six male Kunming mice were randomized into control group(12 mice，given salty water)，memory obtain stage group，memory consolidate stage group and memory reappearance stage group(48 mice in each group)，each group had 3 small groups:high dose，mid dose and low dose group，given alcohol extract of antler velvet dry matter on 1kg/(kg·d)，0.5kg/(kg·d)and 0.1kg/(kg·d)respectively.After 30d，each stage’s latency and number of errors of jumping platform experiment as well as swimming time and number of errors of water maze were tested，at the same time，the activity of SOD and the content of MDA in mind were evaluated.Results:The AVAE could prolong the latency(P＜0.01)of jumping platform experiment on each stage as well as decreasing the number of errors(P＜0.01)obviously，and decrease the swimming time and the number of errors(P＜0.01，P＜0.05)of water maze，then increase the activity of SOD(P＜0.01，P＜0.05)and decrease the content of MDA in mice brain(P＜0.01，P＜0.05).Conclusions:The AVAE had the function of improving learning and memory impairment obviously.

antler velvet alcohol extract(AVAE);learning and memory;jumping platform experiment;water maze experiment

TS201.4

A

1002－0306(2012)10－0343－04

鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿密生茸毛的未骨化幼角［1］。盡管在多細(xì)胞動物中存在器官重生的動物［2］，但鹿茸是哺乳動物界唯一存在的可快速重生的組織器官［3］，在生長季節(jié)其生長率約2cm/d［4］?！侗静菥V目》一書曾將鹿茸列為有極高價值的治療藥劑［5］。鹿茸中含有氨基酸、脂肪酸、脂類、含N類化合物、多糖以及多種對人體有益的微量元素［6］。目前，許多報道證明了鹿茸具有保護(hù)心血管、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合［7］、抗損傷、抗炎、抗老化［8－9］、抗應(yīng)激、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、提高性功能等作用［10］。徐惠波等［11］證明了鹿茸中神經(jīng)節(jié)苷酯可以增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但對于鹿茸醇提物對學(xué)習(xí)記憶能力的研究還未見報道，文獻(xiàn)［12］報道稱鹿茸醇提物中的磷脂具有益智的功效，但未有實驗數(shù)據(jù)支持，本研究以乙醇浸泡法制備的鹿茸醇提物為原料，通過動物實驗證明鹿茸醇提物的益智作用，為鹿茸的深加工利用提供依據(jù)。

2011－07－07

趙玉紅(1968－)，女，博士，副教授，研究方向:林特產(chǎn)品精深加工。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項目(11553036);東北林業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(gram09)。