藍蔚青，謝 晶

(上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306)

傳統(tǒng)生理生化鑒定技術結(jié)合PCR法分析復合保鮮劑對冷藏帶魚貯藏期間菌相變化的影響

藍蔚青，謝 晶*

(上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306)

將微生物傳統(tǒng)生理生化鑒定技術與PCR法相結(jié)合，研究了復合保鮮劑對冷藏帶魚貯藏期間菌相變化的影響。通過對冷藏對照組與保鮮劑處理組樣品貯藏期間的主要微生物進行分離純化、16S rDNA序列分析與生理生化鑒定，并作系統(tǒng)發(fā)育樹分析，最終鑒定出13株具有典型特征的純菌株。對照組樣品在貨架期終點時，其主要微生物的種類與所占比例依次為:腐敗希瓦氏菌(34.7%)、熒光假單胞菌(14.5%)、松鼠葡萄球菌(10.2%)、嗜水氣單胞菌(8.2%)、弧菌(6.1%)、惡臭假單胞菌(6.1%)、綠色氣球菌(4.1%)、金黃色葡萄球菌(4.1%)、蠟樣芽孢桿菌(4.0%)、銅綠假單胞菌(2.0%)、嗜冷桿菌(2.0%)、成團腸桿菌(2.0%)、約氏不動桿菌(2.0%)。其中，腐敗希瓦氏菌為特定優(yōu)勢腐敗微生物。假單胞菌屬在帶魚冷藏過程中所占比例大小依次為熒光假單胞菌＞惡臭假單胞菌＞銅綠假單胞菌。經(jīng)復合保鮮劑處理后，能夠使冷藏帶魚的二級鮮度貨架期延長9d，并使其貯藏期間的細菌菌相組成比例發(fā)生變化，細菌種類減少到9種。主要優(yōu)勢菌的比例明顯減少，表明復合保鮮劑對帶魚體內(nèi)腐敗菌具有不同程度的抑制作用。

帶魚，復合生物保鮮劑，聚合酶鏈反應(PCR)，生理生化鑒定，菌相變化

水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)主要由微生物的作用影響造成，微生物的生長活動決定了水產(chǎn)品質(zhì)量的變化，因此對水產(chǎn)品貯藏過程中細菌菌相變化的研究將有助于對水產(chǎn)品貨架期進行預測，為水產(chǎn)品保藏技術的發(fā)展提供理論基礎［1－2］。帶魚(Trichiurus haumela)又稱裙帶魚、海刀魚、白帶魚等，屬暖溫性近底層魚類，為我國四大經(jīng)濟魚類，具有較高的商業(yè)價值。然而，其常溫下易腐敗，冷藏是目前應用最廣泛、最有效的水產(chǎn)品保鮮方法之一，可有效抑制細菌的增殖速度。鮮魚在貯藏期間細菌種群不斷變化，某些細菌適應此貯藏條件逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位，并產(chǎn)生腐敗臭味和異味等代謝產(chǎn)物，這些細菌就是該產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism)［3］。由于各種細菌的腐敗能力及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，造成對產(chǎn)品不同的腐敗作用，因此研究其腐敗過程不僅需要研究細菌數(shù)量的變化，而且還要了解細菌種類的變化［4］。過去幾十年里，國外學者對新鮮、冷藏過程和腐敗魚類的細菌學開展過部分研究工作［5－7］。近年來，國內(nèi)也有少部分相關報道。裘迪紅［8］等通過生理生化鑒定法對梭子蟹冷藏期間體內(nèi)的腐敗菌菌相變化進行了初步分析。劉壽春［9］等人分析了剛捕獲淡水養(yǎng)殖羅非魚體表不同部位和養(yǎng)殖池水的細菌菌相。郭全友［10］等從菌落和細胞形態(tài)、生理生化特征、細胞脂肪酸組成及同源性分析等方面確定了冷藏養(yǎng)殖大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌。楊憲時［11］等對羅非魚冷藏過程中的細菌種群變化進行了實驗研究，而對于復合保鮮劑對水產(chǎn)品貯藏期間的菌相變化研究還未見報道。本研究利用傳統(tǒng)的微生物分離純化技術與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，分別對復合保鮮劑處理組與冷藏對照組的帶魚樣品貯藏過程中的主要腐敗微生物進行分離與快速鑒定，以揭示在低溫下水產(chǎn)品中主導腐敗微生物的菌相組成。研究結(jié)果將為進一步闡明復合保鮮劑的抑菌機理和實現(xiàn)靶向抑制產(chǎn)品腐敗打下良好的基礎，也為開發(fā)水產(chǎn)品微生物快速鑒定方法提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮帶魚(Trichiurus haumela) 上海市浦東新區(qū)蘆潮港碼頭水產(chǎn)市場，0.25～0.50kg/條，捕獲后立即在冰藏條件下當日運送至實驗室進行實驗;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、NaCl上海市疾病預防控制中心;革蘭氏染液、芽孢染色液、微生物生理生化微量鑒定管 杭州天和生物制劑有限公司;dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA酶 日本TaKaRa BIO株式會社;引物27f、1492r、TAE電泳緩沖液(50×TAE)、Biospin細菌基因組DNA提取盒 生工生物工程(上海)有限公司;DNA純化試劑盒 北京天根生物工程有限公司;溴化已錠染色液(EB)，6×Loading Buffer，Marker:λDNA/Hind III，100bp DNA Ladder，瓊脂糖等。

THZ－82A型氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠;隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHG－9053A型電熱鼓風干燥箱、DK－8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;LDZX－75KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;VS－1300L－U型標準超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司; MiniSpan Plue微型高速離心機 杭州奧盛儀器有限公司;TC－24/H(b)型基因擴增儀 杭州博日科技有限公司;DYY－6C型電泳儀 北京市六一儀器廠; BagMixer VW 拍打式均質(zhì)器 France;電子顯微鏡ZEISS Scope A1.AXIO 上海永傲精密儀器有限公司;Disrupter genie(DNA混勻器)，UVP BioImaging Systems(凝膠成像系統(tǒng))，SANYO MLS－3750高壓滅菌鍋等。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合生物保鮮劑的配制與原料處理

1.2.1.1 復合生物保鮮劑的配制 殼聚糖用1.0%乙酸溶液溶解，依次加入溶菌酶和茶多酚，使其最終配比為殼聚糖10.0g/L、溶菌酶0.3g/L與茶多酚3.0g/L，提前30min配好后立即放入(4±1)℃的冰箱中備用。

1.2.1.2 原料處理 將帶魚洗凈，經(jīng)“三去”處理(去頭、去尾、去內(nèi)臟)，無菌操作切成6～7cm長的魚段，隨機分組，作保鮮或?qū)φ帐褂谩Ｌ幚頃r，將復合保鮮液涂膜于樣品表面，瀝干后依次放入PE保鮮袋，在(4±1)℃的冰箱中貯藏，以蒸餾水處理的帶魚段作為對照組。

1.2.1.3 菌落總數(shù)測定 采用有氧平板菌落計數(shù)法，按GBT 4789.2－2008國標［12］規(guī)定，分別將對照組第1、3、5、8d與復合保鮮劑處理組第1、3、5、8、10、12、16d冷藏帶魚的樣品進行處理。

1.2.2 菌株分離鑒定 通過純培養(yǎng)方法得到多個不同形態(tài)的單菌菌落，根據(jù)菌落外觀與菌體鏡檢形態(tài)對細菌進行初步分類，計算同一種菌落的個數(shù)。

1.2.2.1 菌落與細胞形態(tài)觀察 對分離純化得到的單菌菌落進行形態(tài)觀察記錄與菌落計數(shù)，主要包括菌落大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、菌落隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度與透明度等，并結(jié)合革蘭氏染色與芽孢染色，觀察菌株個體形態(tài)，包括細胞形狀與細胞間的排列方式等，對細菌種類進行初步分類，計算不同處理方式(即對照組與復合生物保鮮劑處理組)在不同貯藏時間的同一類菌落個數(shù)。挑選菌落數(shù)合適(30～300個菌落)的計數(shù)平板，隨機挑取包含不同種類的50個典型單一菌落，平板劃線法反復進行分離純化3次，得到的純化菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基上，以備鑒定。

1.2.2.2 分類保存 根據(jù)菌落特征和形態(tài)學特征，首先將兩種處理方式在不同貯藏時間挑選出來的菌株依次作好標記，進行分組歸類，再將各組菌株進行純培養(yǎng)，重復以上比較。將菌落特征和形態(tài)學特征有差異的重新標記分類，再進行純培養(yǎng)，重復以上操作3次，分離得到純菌株，每一種純菌株作2組平行，記錄細菌的形態(tài)特征。

1.2.3 單細菌DNA提取與純化 將經(jīng)過反復分離純化，進行初步生理生化鑒定得到的純菌株接種到TSB中。在37℃，170r/min的搖床中培養(yǎng)17h，取10mL處于對數(shù)生長期的細菌培養(yǎng)液，在4℃，10000r/min下離心15min，棄上清，將細菌－20℃保存，用于下一步提取DNA［13］。

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，同時增加了溶菌酶破壁，提取出的DNA編號后，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA片段的PCR擴增 以提取的細菌基因組DNA為模板，選用細菌通用引物，正向引物為27f，反向引物為1492r。

表1 冷藏帶魚貯藏期間的細菌特征分析Table 1 Analysis of the properties of bacteria on T.haumela during cold storage

正向引物 27f:5'－GAGAGTTTGATCCTGGC TCAG－3'

反向引物 1492r:5'－CTACGGCTACCTTG TTACGA－3'

PCR擴增采用25.0μL體系，反應條件為2.5μL 10×PCR buffer;2.5μL dNTP(含 Mg2+);0.3μL TaqDNA酶;1.0μL正向引物;1.0μL反向引物;1.0μL DNA模板;16.7μL ddH2O。PCR反應步驟為:a.94℃熱啟動5min;b.94℃預變性5min;c.94℃變性1min; d.57℃退火 1min;e.72℃ 復性 2min;f.72℃ 延伸10min;重復步驟c、d、e 25次。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物約為1500bp。采用DNA純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，獲得的純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.5 16S rDNA測序結(jié)果與生理生化鑒定比對 參照《伯杰手冊》［14］和東秀珠、蔡妙英編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［15］對分類得到的純菌株進行生理生化鑒定，主要包括:氧化酶、接觸酶、淀粉酶、O/F、尿素利用、丙二酸鹽利用、明膠液化、H2S實驗與糖、醇類發(fā)酵實驗等。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 測序得到菌株部分長度的16S rDNA序列(約1460bp)，將測序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，通過Blast程序與GenBank中的核酸序列進行比對，從中選出相似性較高的序列，應用Chromas version1.62和DNAMAN version6.0軟件進行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 復合保鮮劑處理后冷藏帶魚細菌總數(shù)的變化

參照鮮帶魚［16］與鮮海水魚［17］國標規(guī)定，細菌總數(shù)≤4lgCFU/g為一級鮮度，4lgCFU/g＜細菌總數(shù)≤6lgCFU/g為二級鮮度。由圖1可知，在冷藏的第3d與第5d后，對照組冷藏帶魚的細菌總數(shù)已先后超過了一級與二級鮮度，在冷藏的第8d后，其細菌總數(shù)更達到8.75lgCFU/g，樣品已完全腐敗。而復合保鮮劑處理組在冷藏初期的細菌總數(shù)有所下降，其主要原因在于殼聚糖與溶菌酶本身具有抑菌與殺菌作用，到冷藏的第16d，細菌總數(shù)才超過二級鮮度標準?？梢?，殼聚糖復合保鮮劑涂膜處理能很好的抑制微生物生長繁殖，延緩帶魚的腐敗變質(zhì)。從菌落總數(shù)的數(shù)值變化程度和趨勢來看，符合帶魚在冷藏條件下的腐敗發(fā)展趨勢，分離純化所選的時間間隔具有代表性。

圖1 復合保鮮劑對冷藏帶魚貯藏期間細菌總數(shù)變化的影響Fig.1 Effect of CBFA on total viable counts of T.haumela during cold storage

2.2 冷藏帶魚的細菌菌落特征

采用稀釋平板分離法和劃線分離法，經(jīng)過3次以上的比較分組與歸類計數(shù)，一共從不同貯藏時間的對照組與復合保鮮劑處理組冷藏帶魚樣品中主要分離出13種典型菌，分別命名為X1、X2……X13，其菌落與細菌的基本特征見表1。

2.3 單菌落DNA的提取

對分離得到的13種未知菌株進行單細菌DNA提取，并利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在23kb左右出現(xiàn)條帶，表明已獲得較為完整微生物基因組的DNA，圖2為13種主要代表性菌株的DNA電泳圖譜。

2.4 菌株的16S rDNA基因序列

通過引物27f和1492r對13株活化菌進行16S全長序列的PCR擴增，均得到重復性好且穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段大小為1500bp左右，電泳圖譜結(jié)果如圖3所示。

2.5 16S rDNA測序結(jié)果與生理生化鑒定比對

帶魚冷藏貨架期結(jié)束時，其菌相趨于簡單，貯藏期間的主要優(yōu)勢菌為X1和X2兩種，通過對冷藏帶魚貯藏期間6種主要優(yōu)勢菌株進行生理生化鑒定，其各項生理生化指標結(jié)果見表2。

表2 冷藏帶魚貯藏期間主要優(yōu)勢菌的生理生化特征Table 2 The physiology and biological test of T.haumela during cold storage

表3 主要優(yōu)勢菌X1與X2同源性較高的菌株分析Table 3 Analysis of high homologies of strains of X1and X2

圖213 種菌株的DNA電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic analysis of DNA from thirteen samples

圖3 13種菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic analysis of PCR amplification products of the 16S rDNA gene fragments from thirteen samples

參照GenBank比對的結(jié)果作相應的生理生化實驗(表2)，并依據(jù)主要的生理生化反應和菌落特征，可判斷出X1為希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)中的一種，X2與X3分別為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)細菌，X4為嗜冷桿菌屬(Psychrobacter sp.)中的一種，X5為氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)中的細菌，X10為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)中的一種，其余7種菌均在PCR擴增測序結(jié)果比對的基礎上，結(jié)合生理生化鑒定加以鑒別得出其各自屬種。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將13株分離細菌所獲得的16S rDNA序列提交NCBI，獲得它們在GenBank數(shù)據(jù)庫中的臨時登錄號。通過BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進行同源性比較分析，選取同源性多數(shù)在99%以上的7個菌株進行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)親緣關系遠近判斷細菌種類。其中，分別對優(yōu)勢菌X1與X2作同源性搜索(見表3)，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)。

由圖4可見X1與希瓦氏菌(Shewanella sp.)的親緣關系較近，且 X1與腐敗希瓦氏菌(登錄號: GU930786.1)在同一分支中，結(jié)合生理生化反應可證明X1為腐敗希瓦氏菌。X2與假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)親緣關系較近，且與熒光假單胞菌(登錄號:HQ874650.1)在同一分支中，結(jié)合生理生化反應，可證明X2為假單胞菌屬中的熒光假單胞菌。對其余11種菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并結(jié)合生理生化反應結(jié)果，可得X3為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，X4為嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)，X5為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，X6為弧菌(Vibrio rumoiensis)，X7為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，X8為 成 團 腸 桿 菌 (Enterobacter agglomerans)，X9為約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)，X10為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)，X11為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，X12為綠色氣球菌(Aerococcusviridans)，X13為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。

表4 帶魚冷藏過程中細菌的組成比例(%)Table 4 Proportion of bacteria changes and composition of T.haumela during cold storage(%)

表5 復合保鮮劑處理組帶魚冷藏過程中細菌的組成比例(%)Table 5 Proportion of bacteria changes and composition of T.haumela with CBFA during cold storage(%)

圖4 基于16S rDNA序列同源性的X1與X2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the X1and X2strains based on the16S rDNA sequences

2.7 帶魚冷藏過程中的菌相組成及變化情況

根據(jù)對13種菌株的PCR擴增測序與生理生化鑒定結(jié)果，分別對不同天次冷藏對照組與復合保鮮劑處理組的帶魚樣品，經(jīng)反復分離純化與比較分類的典型菌株進行計數(shù)，計算其各自所占比例，帶魚冷藏過程中細菌組成及其變化情況見表4與表5。

由表4與表5可知，兩組帶魚樣品在貨架期終點時均為革蘭氏陰性菌占絕對優(yōu)勢，這一結(jié)果與Hubbs［18］的研究一致。與對照組相比，經(jīng)復合保鮮劑處理后，冷藏帶魚的細菌菌相有明顯變化:第一，細菌的種類數(shù)量有所減少，隨著貨架期的結(jié)束，復合保鮮劑處理組的主要腐敗菌種類由原來的13種減少到9種，其中嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)、綠色氣球菌(Aerococcus viridans)在貯藏的第5d未檢出，成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)在冷藏的第12d未檢出，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)在冷藏的第14d未檢出;第二，革蘭氏陰性菌的比例有所增加，在冷藏的第8d，處理組的82.1%高于對照組的77.6%，在冷藏的第16d時增加到88.4%;第三，優(yōu)勢腐敗菌種類不變，仍為腐敗希瓦氏菌與熒光假單胞菌，但冷藏帶魚經(jīng)復合保鮮劑處理后，其所占比例明顯減少。

3 結(jié)論

帶魚冷藏過程中，隨著貯藏時間的延長，其細菌種類趨于穩(wěn)定。基于16S rDNA的分子生物學方法對細菌種類進行鑒定與傳統(tǒng)的生理生化反應鑒定方法有較好的一致性。在冷藏貨架期結(jié)束時，帶魚的主要優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)與 熒 光 假 單 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens)。腐敗希瓦氏菌大量存在于水和土壤中，水產(chǎn)品攜帶較多，此前也將希瓦氏菌屬歸類到假單胞菌屬，被稱為腐敗交替假單胞菌。Gill［19－20］等人研究認為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)是冷鏈流通中高水分蛋白食品的特定腐敗菌SSO(Specific spoilage organisms)。貯藏過程中腐敗希瓦氏菌會產(chǎn)生H2S和不良氣味，同時導致肉變色、發(fā)粘，這可能是帶魚腐敗的一個主要原因。熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)為假單胞菌科假單胞菌屬桿菌，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色呈陰性，其廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動物活動環(huán)境中。假單胞菌也是水產(chǎn)動物常見的腐敗菌，在帶魚冷藏過程中其數(shù)量變化不大，但仍占一定比例，其中冷藏帶魚中的假單胞菌所占比例大小依次為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)＞惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)＞銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本研究結(jié)合細菌的生理生化反應和16S rDNA序列比對的方法，初步鑒定了帶魚在冷藏過程中的細菌組成，并與對復合保鮮劑處理組的細菌組成比例進行比較，為今后研究復合保鮮劑的抑菌機理指明了方向。

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Effect of complex biological fresh－keeping agents for the main bacteria composition on cutlassfish Trichiurus haumela under the cold storage by PCR and physiology－biochemistry technology

LAN Wei－qing，XIE Jing*
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aqhatic－product Processing＆Preservation，Shanghai 201306，China)

Microbial physiology－biochemistry technology in traditional method combined with PCR technology were used to study the effect of Complex Biological Fresh－keeping Agents(CBFA)on Trichiurus haumela.After the separation and purification of pre－dominate spoilage bacteria on Trichiurus haumela used by CBFA under the cold storage，16S rDNA sequence analysis，morphological and biochemical tests were used to identify the composition of spoilage microflora，and phylogenetic tree were analyzed.The result showed that there were mainly 13 typical bacterial strains of the controlled，and their proportions at the end of shelf life in control groups were:Shewanella putrefaciens 34.7%，Pseudomonas fluorescens 14.5%，Staphylococcus sciuri 10.2%，Aeromonas hydrophila 8.2%，Vibrio rumoiensis 6.1%，Pseudomonas putida 6.1%，Aerococcus viridans 4.1%，Staphyloccocus aureus 4.1%，Bacillus cereus 4.0%，Pseudomonas aeruginosa 2.0%，Psychrobacter sp.2.0% Enterobacter agglomerans 2.0% and Acinetobacter johnsonii 2.0%respectively.Among them，Shewanella putrefaciens(34.7%)was the Specific Spoilage Organism(SSO)，the proportion of Pseudomonas sp.in descending order was Pseudomonas fluorescens＞Pseudomonas putida＞Pseudomonas aeruginosa.It was found that the dominant spoilage bacteria of Trichiurus haumela was extended 9d by CBFA，the spoilage microflora was also changed，and the species of bacteria decreased to 9 strains.CBFA showed different inhibitory activity on different spoilage bacteria.

Trichiurus haumela;complex biological fresh－keeping agents(CBFA);polymerase chain reaction (PCR);physiology－biochemistry technology;microflora changes

TS254.4

A

1002－0306(2012)10－0330－06

2011－07－01 *通訊聯(lián)系人

藍蔚青(1977－)，男，工學博士，助理研究員，研究方向:食品冷凍冷藏工程。

“十二五”國家支撐計劃項目(2012BAD38B09);上海市科委工程中心建設(11DZ2280300);上海海洋大學博士啟動基金(A－2400－11－0202);上海市教育委員會重點學科建設項目資助(J50704)。