鐘勝佳，石巖，熊婧，魏鋒，肖新月，馬雙成，林瑞超

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.湖南省益陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 益陽 413000)

人工牛黃中牛磺酸成分的含量測定

鐘勝佳2，石巖1*，熊婧1，魏鋒1，肖新月1，馬雙成1，林瑞超1

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.湖南省益陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 益陽 413000)

目的建立人工牛黃中?；撬岬暮繙y定方法。方法以異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑衍生后進(jìn)行HPLC分析，采用C18色譜柱，柱溫為43 ℃；醋酸鈉緩沖液-乙腈體系為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1；檢測波長為243 nm。結(jié)果?；撬嵩?.034～0.34 μg與峰面積呈良好線關(guān)系，r=0.999 9，平均回收率為102.19%，RSD=0.94%(n=6)。結(jié)論該方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好。

人工牛黃；?；撬?；衍生化；高效液相色譜法；異硫氰酸苯酯

牛黃是牛科動(dòng)物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥膽結(jié)石，系名貴中藥材，但其資源匱乏，目前市場流通多以人工牛黃以及體外培育牛黃等牛黃替代品為主[1-2]。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，其配方較為復(fù)雜。其中的?；撬嶙钤缡怯膳｜S中分離得到的，具有抗疲勞、解熱鎮(zhèn)痛等作用，又名牛膽堿、氨基乙磺酸、2-氨基乙磺酸，是中藥及保健食品中的重要指標(biāo)性成分，其測定方法有薄層色譜法、化學(xué)滴定法、柱前衍生化液相色譜法、氨基酸分析儀法和比色法等，現(xiàn)行《中國藥典》人工牛黃項(xiàng)僅收載了?；撬岬谋予b別，缺少對其的含量測定方法[3-10]。由于?；撬嶙钤缡菑呐｜S中來，并且具有與牛黃相近的功效，所以對于人工牛黃中?；撬岬馁|(zhì)量控制僅僅停留在薄層鑒別上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。本文針對?；撬釤o紫外吸收的性質(zhì)，建立了柱前衍生化法，用以測定人工牛黃中的?；撬岷浚〉昧溯^好的結(jié)果。

1 儀器與試藥

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2489紫外/可見檢測器，EMPOWER工作站。?；撬釋φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111616-201002)。

試劑：乙腈為色譜純，醋酸鈉、三乙胺、鹽酸、醋酸為分析純，異硫氰酸苯酯(PITC,購自Sigma公司，標(biāo)示純度≥99.0%)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent EclipseC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為43 ℃。以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用醋酸調(diào)pH值至6.5)(7∶93)為流動(dòng)相A，以乙腈-水(4∶1)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫：0～12 min，0%→8%B；12～17 min，8%→100%B；17～18 min，100%B；18～30 min，100%→0%B；30～35 min，0%B。流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為243 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取?；撬釋φ掌芳s16 mg，加水溶解并定容至100 mL，搖勻，即得?；撬釋φ掌穬?chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液5 mL置于25 mL 量瓶中，加入0.1 mol·L-1PITC溶液2.5 mL和1 mol·L-1三乙胺溶液2.5 mL，室溫放置60 min，加50%乙腈定容至刻度，搖勻，取10 mL，加正己烷10 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取人工牛黃樣品粉末約40 mg置于25 mL量瓶中，加水20 mL，超聲15 min，再加水定容至刻度，搖勻。精密量取該溶液5 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.2.3 空白溶液 精密量取水5 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各5 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果?；撬嵘V峰分離度良好，空白無干擾。理論塔板數(shù)按?；撬嵊?jì)為127 421，分離度大于1.5。HPLC圖見圖1。

A.空白 B.對照品 C.樣品 1.?；撬釄D1 ?；撬嶂把苌疕PLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取?；撬釋φ掌芳s16 mg置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻。分別精密量取該溶液1,2,3，4，5，10 mL置于10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，再分別精密吸取上述對照品溶液5 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，制成線性對照品溶液1～6。按2.1色譜條件，注入液相色譜儀，測得峰面積，分別以?；撬釋φ掌返倪M(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=6 552 614X-8 043，r=0.999 9，牛磺酸進(jìn)樣量在0.034～0.34 μg與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取一份對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得?；撬岬腞SD=0.30%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品溶液，按上述色譜條件分別于0，3，7，10，17，24 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算得牛磺酸色譜峰的RSD=1.81%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，每份約40 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定含量，計(jì)算得?；撬岷科骄禐?0.55%(n=6)，RSD=1.68%。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取1號(hào)樣品6份，每份約20 mg，精密加入?；撬釋φ掌啡芤?0.218 44 mg·mL-1)10 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法操作，制備所需溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 ?；撬峄厥章试囼?yàn)結(jié)果

注：?；撬釋φ掌芳尤肓烤鶠?.184 4 mg

2.9 耐用性試驗(yàn)

為了考察不同色譜柱對測定結(jié)果的影響，特選取3個(gè)不同廠家色譜柱對1號(hào)樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明用不同牌號(hào)色譜柱測得的供試品中牛磺酸含量相差不大，該方法對不同C18色譜柱耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

用上述方法對市售不同廠家的3批人工牛黃樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果見表3。

表3 3批人工牛黃樣品測定結(jié)果

3 討論

分別考察了超聲提取人工牛黃10，15，20 min的情況，發(fā)現(xiàn)超聲提取15 min已經(jīng)達(dá)到提取的最大值，故選擇15 min為提取時(shí)間。

對衍生化后的牛磺酸對照品進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)243 nm為最大吸收波長，故選擇243 nm為檢測波長。

本文利用?；撬峥膳c異硫氰酸苯酯結(jié)合成為穩(wěn)定并且有較強(qiáng)紫外吸收的衍生化產(chǎn)物這一性質(zhì)，研究建立了異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定人工牛黃中?；撬岬姆椒?，并經(jīng)過相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用作人工牛黃中牛磺酸指標(biāo)的質(zhì)量控制。

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DeterminationofTaurineinArtificialCow-bezoanbyHPLCwithPrecolumnPhenylisothiocyanateDerivatization

ZHONG Sheng-jia2，SHI Yan1，XIONG Jing1，WEI Feng1，XIAO Xin-yue1，MA Shuang-cheng1，LIN Rui-chao1

(1.NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050；2.YiyangInstituteforFoodandDrugControl,Yiyang413000,China)

Objective：To establish an HPLC method to determine the content of taurine in artificial cow-bezoan.MethodsAn HPLC system was equipped with a C18column.Phenyl iso-thiocyanate(PITC) was used for the pre-column derivatization of taurine.The mobile phase consisted of sodium acetate buffer solution-acetonitrile-water.Flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 243 nm.ResultsThe linear range was 0.034～0.34 μg(r=0.999 9).The recovery was 102.19%，RSD was 0.94%(n=6).ConclusionThe method is accurate and practical,the result is satisfied.

Artificial cow-bezoan；Taurine；Derivatization；HPLC；PITC

*

石巖，Tel：(010)67095432，E-mail：san0373@yahoo.com.cn

2012-06-19)