張洪斌，凌國慶，胡雪芹，凡 寧

(合肥工業(yè)大學(xué)制藥工程系，安徽 合肥 230009)

N+注入誘變選育β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化

張洪斌，凌國慶，胡雪芹，凡 寧

(合肥工業(yè)大學(xué)制藥工程系，安徽 合肥 230009)

以一株產(chǎn)β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的蠟狀芽孢桿菌BC-0801為出發(fā)菌株，利用10keV，劑量為40× 2.5×1013ions/cm2氮離子進(jìn)行誘變選育，獲得一株高產(chǎn)β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體BC-0802。對該突變體BC-0802發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機(jī)離子進(jìn)行單因素試驗分析，采用3個因素正交試驗確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分質(zhì)量濃度及發(fā)酵條件為：玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO4 1g/L，發(fā)酵溫度30℃、pH 9.0、接種量2%、發(fā)酵周期36h。結(jié)果表明；突變體的平均酶活力可達(dá)3415.8U/mL，相較于出發(fā)菌株酶活力提高了3.67倍，且該突變體的遺傳穩(wěn)定性較好。

N+注入；β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；篩選；誘變；工藝優(yōu)化

環(huán)狀糊精(cyclodextrin，CD)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元，根據(jù)組成葡萄糖基個數(shù)不同分別叫做α-、β-、γ-環(huán)狀糊精(葡萄糖基數(shù)分別為6、7、8)[1]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。β-環(huán)狀糊精分子呈錐形的圓環(huán)狀，它的內(nèi)側(cè)是由—CH及葡萄糖苷鍵的氧原子組成，呈疏水性；而它的外側(cè)開口處一端是2,3位羥基，另一端是6位羥基，因而C D外側(cè)呈親水性；由于其“內(nèi)疏水，外親水”的特殊分子結(jié)構(gòu)，使得CD能與多種有機(jī)小分子形成特殊結(jié)構(gòu)的包合物，改變配體物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，可起到保護(hù)、抗光、抗熱、提高溶解度、改變劑型、掩蓋異味、提高生物利用度等特殊作用[2]。由于β-環(huán)狀糊精在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等許多方面有重要用途，篩選獲取用來生產(chǎn)β-環(huán)狀糊精的高活性β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)越來越受到重視。

β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β-cyclodextrin glucanotransferase，β-CGTase)是催化淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物合成β-CD的酶，屬于α-淀粉酶家族，可用于β-CD的生產(chǎn)[3]，還可用于一些糖類的化學(xué)改性[4]。Park等[5]利用β-CGTase的轉(zhuǎn)糖基作用將纖維二糖合成一種新的四糖，經(jīng)鑒定是一種新的物質(zhì)。β-CGTase至今已從數(shù)10種微生物中分離得到，如Bacillus macerans[6]、B.ohbensis[7]、Klebsiella pneumonia[8]、B. stearothermophilus[9]、Bacillus circulans[10]。大多數(shù)的β-CGTase由于活力低而無法滿足工業(yè)生產(chǎn)，為了獲取適合工業(yè)化生產(chǎn)的β-CGTase產(chǎn)酶菌株，對產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變育種，以提高酶的活力，是選育β-CGTase高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵手段。廖偉等[11]報道了一株產(chǎn)β-CGTase的菌株，原始菌株的酶活為634.37U/mL，經(jīng)誘變后酶活力達(dá)到了1500U/mL左右。何飛燕等[12]通過紫外-氯化鋰的雙重誘變育種的方法，將從土壤分離物中篩選到1株β-CGTase產(chǎn)生菌gxmf1，經(jīng)誘變處理后，篩選得到突變株B15，酶活力達(dá)5416U/mL，較出發(fā)菌株提高255%。誘變育種的方法有很多，特別是N+注入誘變育種，能以較小的損傷得到較高的正突變率和較廣譜的突變率，有成本低廉、對人體及環(huán)境無害的優(yōu)點，是一種新型的誘變育種的方法[13]，因此，利用離子注入誘變進(jìn)行微生物誘變選育在科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用[14-15]。但是到目前為止，對用N+注入誘變的方法篩選高產(chǎn)β-CGTase的研究，文獻(xiàn)報道較少。

圖1 α-、β-、γ-環(huán)狀糊精的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of α-, β-, andγ- cyclodextrin

本實驗通過從土壤篩選并得到一株高產(chǎn)β-CGTase的菌株BC-0801。通過對其進(jìn)行N+注入誘變育種，得到高產(chǎn)β-CGTase的突變體BC-0802，并優(yōu)化其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。該菌株所產(chǎn)的β-CGTase活性較高，且菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，具有適合工業(yè)生產(chǎn)β-環(huán)狀糊精的應(yīng)用潛力，對于β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的Bacillus cereus BC-0801，本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

甲基橙、碘液醋酸、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、酚酞，以上均為分析純；淀粉、酵母浸膏、蛋白胨、瓊脂粉等。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10、蛋白胨10、酵母浸膏5、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、酚酞0.3、甲基橙0.1、瓊脂粉20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉10、玉米漿10、蛋白胨10、酵母浸膏5、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B生化培養(yǎng)箱 中國科學(xué)院等離子研究所；WFZ800-D3B紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；ZHWY-2102恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；COIC XSZ-G光學(xué)顯微鏡 重慶光學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 低能N+注入工藝及樣品處理

取新鮮活化斜面，用無菌水洗脫后制成濃度約為1×106個/mL的懸液，取5mL合適濃度的菌懸液和5mL 30%的甘油混合，搖勻后取0.1mL均勻涂布在無菌平板上，置于超凈操作臺下由無菌風(fēng)吹干后進(jìn)行N+注入。該工作在中國科學(xué)院合肥科學(xué)島離子束生物工程重點實驗室進(jìn)行，選擇注入能量為10keV，注入劑量為(10～120)× 2.5×1013ions/cm2，真空度為10-3Pa。離子注入完畢后，用1mL無菌水清洗平板上的菌膜，用移液槍反復(fù)沖洗幾次以使菌液均勻，然后移取0.1mL于無菌空白平板上，倒入融化的篩選固體培養(yǎng)基(約50℃)，振蕩均勻，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，記錄單菌落的形態(tài)及個數(shù)，繪制存活率曲線。

1.3.2 高產(chǎn)β-CGTase突變菌株的篩選

以菌株產(chǎn)β-CGTase水解淀粉的酶活力大小進(jìn)行篩選。活性菌株的篩選的原理是根據(jù)選的原理是根據(jù)β-CGTase可以水解淀粉產(chǎn)生β-環(huán)狀糊精，而β-環(huán)狀糊精與甲基橙和酚酞染料反應(yīng)形成復(fù)合物，可在培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)黃色透明圈[11]。選取平板上黃色透明圈較大的菌株，用搖瓶復(fù)篩，再對復(fù)篩獲得的突變菌株的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1.3.3 碳源對β-CGTase活力的影響

1.3.3.1 不同碳源對酶活力的影響

選擇玉米粉、玉米漿、可溶性淀粉、葡萄糖作為碳源，在不含碳源的培養(yǎng)基上分別添加10g/L以上幾種碳源，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.3.2 碳源質(zhì)量濃度的選擇

選擇較為廉價的玉米粉作為碳源，在不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上分別添加5、10、15、20、25、30g/L的玉米粉，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.4 氮源對β-CGTase活力的影響

1.3.4.1 不同氮源對酶活力的影響

選擇蛋白胨、酵母浸膏、NH4NO3、(NH4)2SO4為氮源，在不含氮源的培養(yǎng)基上分別添加10g/L以上幾種氮源，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.4.2 氮源質(zhì)量濃度的選擇

選擇酶活較高的酵母浸膏作為氮源，在不含氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基上分別添加2.5、5、7.5、10、15、20g/L的酵母浸膏，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.5 無機(jī)離子對產(chǎn)酶的影響

1.3.5.1 不同無機(jī)離子對產(chǎn)酶的影響

選取對實驗影響較大K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2這3種無機(jī)鹽組分，在不含其他無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中添加上述幾種無機(jī)鹽，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.5.2 無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的選擇

選擇酶活較高的K2HPO4作為無機(jī)鹽，在不含無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基上分別添加0.5、1、1.5、2、2.5、3g/L的K2HPO4，接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h后，測發(fā)酵液的酶活力。

1.3.6 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

該蠟狀芽孢桿菌為嗜堿性，所以選取pH值的梯度為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按5%的接種量接種，然后將培養(yǎng)基在30℃，200r/min的搖床上培養(yǎng)36h，取樣，在700nm波長處測定酶活力。

1.3.7 接種量對產(chǎn)酶的影響

分別選取接種量為2%、4%、6%、8%、10%。然后將培養(yǎng)基在30℃，200r/min搖床培養(yǎng)36h，取樣，在700nm波長處測定酶活力。

1.3.8 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

在30℃、200r/min發(fā)酵24h后每隔6h定時取樣，在700nm波長處測酶活力。

1.3.9 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

分別選取28、29、30、31、32℃，然后將培養(yǎng)基在30℃、200r/min的搖床上培養(yǎng)36h，取樣，在700nm波長處測酶活力。

1.3.10 正交試驗設(shè)計

根據(jù)碳源、氮源、無機(jī)鹽的單因素分析結(jié)果，設(shè)計了三因素三水平正交試驗因素表，在接種量為5%，30℃、200r/min培養(yǎng)72h的條件下，測定發(fā)酵液的酶活力。

1.3.11 酶活力的測定

取10μ L適當(dāng)稀釋的酶液，加入0.2mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)0.2mL，再加入0.2%可溶性淀粉0.2mL，振蕩，于40℃水浴10min，立即加入0.5mL/L醋酸0.5mL終止反應(yīng)，然后加入0.005%碘液顯色3mL，同時以蒸餾水為空白，不加酶液為對照，在700nm波長處測定吸光度，一個酶活力單位定義為使吸光度下降10%的酶量。

式中：A0為對照組的吸光度；A為樣品的吸光度。

1.4 離子注入誘變效果的計算

1.4.1 存活率計算

以不經(jīng)誘變的菌株為對照組，再分別統(tǒng)計對照組和離子注入組的菌落總數(shù)，按式(2)計算存活率。

1.4.2 突變率的計算

挑取離子注入后的單菌落分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液的酶活力，以原始出發(fā)菌株為對照，酶活力提高5%為正突變，降低5%為負(fù)突變，其他視為未突變。正突變率、負(fù)突變率、總突變率的計算按式(3)、(4)、(5)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入誘變篩選高產(chǎn)β-CGTase突變菌株

2.1.1 誘變劑量的確定

對Bacillus cereus BC-0801采用N+注入誘變，在10keV注入能量下，統(tǒng)計不同劑量的存活菌落數(shù)，計算各注入劑量的致死率，繪制致死率曲線，如圖2所示。分別在不同劑量下挑取單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定酶活力，同時與原始出發(fā)菌株對照計算突變率。結(jié)果見圖3。

圖2 N+注入劑量對菌體存活率的影響Fig.2 Cell survival of Bacillus cereus treated with different doses of N+ implantation

由圖2可知，當(dāng)N+注入劑量低于20×2.5×1013ions/cm2時，菌體的存活率隨注入劑量的增大而迅速降低；當(dāng)劑量達(dá)到約40×2.5×1013ions/cm2時，存活率隨著注入劑量的增加逐漸增加，在40×2.5×1013ions/cm2處達(dá)到最大，菌株的存活率為26.6%。但超過40×2.5× 1013ions/cm2之后，存活率又逐漸下降，整個變化曲線呈“馬鞍型”。

圖3 N+注入劑量對菌體突變的影響Fig.3 Effect of N+ implantation dose on bacterial mutation

由圖3可知，隨著注入劑量的增加，菌體的突變率在增加，而菌體的正突變率則隨著注入劑量的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在40×2.5×1013ions/cm2時達(dá)到最大，超過此劑量后，菌體的突變率雖然增加，但正突變率卻在減小。故選定在該劑量下進(jìn)行離子注入誘變，可以得到更多的正突變。

2.1.2 誘變、篩選的高產(chǎn)β-CGTase菌株及遺傳穩(wěn)定性采用最佳注入劑量40×2.5×1013ions/cm2對Bacillus cereus BC-0801進(jìn)行N+注入誘變處理，挑取誘變處理后可以產(chǎn)生透明圈的約200株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，最終得到1株耐堿性中溫β-CGTase產(chǎn)量較高的菌株，編號為BC-0802。突變菌株從6h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，24h后進(jìn)入平臺期，這時β-CGTase的酶活力逐漸上升，在36h后，培養(yǎng)基中的β-CGTase的酶活力達(dá)到最大，可達(dá)3500U/mL。將突變菌株在平板上轉(zhuǎn)接8代后，將不同傳代次數(shù)的菌株在最適條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液的酶活力，BC-0802各代搖瓶發(fā)酵β-CGTase的酶活力穩(wěn)定在(2000±200)U/mL范圍內(nèi)，說明該菌株的穩(wěn)定性比較好。

2.2 碳源對酶活力的影響

2.2.1 不同碳源對酶活力的影響

表1 不同碳源對菌株產(chǎn)β-CGTase的影響Table 1 Effect of different carbon sources on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

碳源是微生物能量的主要來源，不同碳源對菌株產(chǎn)β-CGTase酶活的影響結(jié)果見表2。可以看出，突變菌株BC-0802在以玉米粉為碳源時產(chǎn)酶的酶活力比其他碳源的高很多，且從市場成本來考慮，玉米粉也是最好的碳源。可見，玉米粉是突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源。

2.2.2 碳源質(zhì)量濃度的確定

圖4 碳源質(zhì)量濃度的確定Fig.4 Effect of corn flour concentration in the medium onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖4可知，發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力是隨著玉米粉的質(zhì)量濃度增加而增加，但到25g/L左右，增加趨于平緩，在30g/L時最大，但如果玉米粉的質(zhì)量濃度如果超過30g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基會有很多懸浮的玉米粉，會對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，所以玉米粉的最適質(zhì)量濃度為30g/L。

2.3 氮源對酶活力的影響

2.3.1 不同氮源對酶活力的影響

表2 不同氮源對菌株產(chǎn)β-CGTase的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

從表2可以看出，突變菌株BC-0802在以酵母浸膏的為氮源時，產(chǎn)酶的酶活力比其他氮源高很多；以(NH4)2SO4和NH4NO3作為氮源時，產(chǎn)酶活力較小，說明菌株不太適合以無機(jī)氮源發(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果表明，酵母浸膏為突變菌株的最適氮源。

2.3.2 氮源質(zhì)量濃度的確定

圖5 氮源質(zhì)量濃度的確定Fig.5 Effect of yeast extract concentration in the medium on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖5可知，隨著酵母浸膏質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)酶的酶活力會增加；當(dāng)酵母浸膏的質(zhì)量濃度達(dá)到15g/L時，β-CGTase的酶活力最高；但隨著酵母浸膏質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，產(chǎn)酶的酶活逐漸降低，發(fā)酵液的顏色逐漸加深，為后面的酶分離純化帶來困難，所以選定酵母浸膏的質(zhì)量濃度為15g/L。

2.4 無機(jī)鹽對酶活力的影響

2.4.1 不同無機(jī)鹽對酶活力的影響

表3 不同無機(jī)鹽對菌株產(chǎn)β-CGTase的影響Table 3 Effect of different inorganic salts on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

從表3可以看出，突變菌株BC-0802在以K2HPO4為無機(jī)鹽時產(chǎn)酶的酶活力最高，而且K2HPO4的價格最便宜，所以選擇K2HPO4為最適無機(jī)鹽?？梢?，K2HPO4為突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機(jī)鹽。

2.4.2 無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的確定

圖6 無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的確定Fig.6 Effect of K2HPO4 concentration in the medium on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖6可知，隨著K2HPO4質(zhì)量濃度的增加，突變菌株產(chǎn)酶活力逐漸增加，在1g/L時達(dá)到最高；當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度超過1g/L時，突變菌株產(chǎn)酶活力逐漸降低，可能是無機(jī)鹽質(zhì)量濃度過高會抑制該菌株的生長和酶的表達(dá)。K2HPO4的最佳質(zhì)量濃度為1g/L。

2.5 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

圖7 初始pH對酶活力的影響Fig.7 Effect of initial medium pH onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖7可知，隨著pH值的增加，突變菌株產(chǎn)酶的活力在增加，在pH9.0時酶活力最高；當(dāng)pH值超過9.0時，突變菌株產(chǎn)酶的活力隨pH值的增大反而降低，可能是堿性太強(qiáng)，抑制了酶的活性。該菌株適宜在pH值為9.0條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.6 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖8 接種量對酶活力的影響Fig. 8 Effect of inoculum size on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖8可知，突變菌株產(chǎn)酶的活力隨著接種量的增加而增加，在接種量為2%時酶活最高，但當(dāng)接種量超過2%后，突變菌株產(chǎn)酶活力略有降低。該突變菌株發(fā)酵的最佳接種量為2%。

2.7 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

圖9 發(fā)酵時間對酶活力的影響Fig.9 Effect of culture time onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖9可知，突變菌株產(chǎn)酶的活力隨著發(fā)件時間的延長而增加，在36h時達(dá)到最大，說明在這段時間酶表達(dá)量在增加；在36～48h之間產(chǎn)酶的增量不大，但超過48h后，酶活力反而隨時間的延長而降低，可能是在堿性環(huán)境下酶活力有損失。該突變菌株的最適發(fā)酵時間為36h。

2.8 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

圖10 發(fā)酵溫度對酶活力的影響Fig.10 Effect of culture temperature on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖10可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，突變菌株產(chǎn)酶的活力在增加，在30℃時達(dá)到最大，可能是由于隨著溫度的增加有利于該菌株生長，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，突變菌株的產(chǎn)酶活力反而下降。該突變菌株的最適發(fā)酵溫度為30℃。

2.9 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響β-CGTase酶活力的碳源、氮源、無機(jī)鹽離子3個因素按照不同質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果見表4。因素的主次順序為：A (碳源)＞B(氮源)＞C(無機(jī)鹽)，從直觀分析可知，最優(yōu)水平為A2B2C3，即玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L時酶活力最高。

表4 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal array design arrangement and corresponding experimental results for optimization of fermentation medium

2.10 驗證實驗

按照正交試驗所得的最佳發(fā)酵條件：玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L載接種量2%、30℃、200r/min條件下培養(yǎng)48h后，重復(fù)5次實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果分別是：3457.5、3513.6、3217.2、3420、3470.5U/mL，平均酶活力為3415.8U/mL，結(jié)果波動在可信范圍內(nèi)，故正交試驗結(jié)果是合理的。

3 結(jié) 論

本實驗室通過N+注入誘變的方法，在10keV，注入劑量為40×2.5×1013ions/cm2的條件下，篩選得到得到一株新的高產(chǎn)β-CGTase的突變體BC-0802。通過對該突變體菌株的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其在搖瓶發(fā)酵時產(chǎn)酶的酶活力可最高達(dá)3415.8U/mL，較出發(fā)菌株提高了3.67倍，并且能穩(wěn)定的遺傳。該產(chǎn)酶菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，并且酶活處在較高的水平，適宜用做工業(yè)化生產(chǎn)，為β-CGTase的工業(yè)應(yīng)用提供一定的參考。

[1]SZEJTLI J. The cyclodextrins and their applications in biotechnology [J]. Carbohydr Polym, 1990, 12: 375-392.

[2]王雁萍, 談重芳. Bacillus sp. HA-1產(chǎn)環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2006(2): 12-15.

[3]TONKOVA A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1998, 22(8): 678-686.

[4]WONGSANGWATTANA W, KAULPIBOON J, ITO K, et al. Synthe-sis of cellobiose-containing oligosaccharides by intermolecular transglucosylation of cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus sp. A11[J]. Process Biochemistry, 2010, 45: 947-953.

[5]PARK D C, KIM T K, LEE Y H. Characterise of transglycosylation reaction of cyclodextrin glucanotransferase in the heterogeneous enzyme reaction system using extrusion starch as a glucosyldonor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1998, 22: 217-222.

[6]ISMAIL A M S, SOBIEH U I, ABDEL-FATTAH A F. Biosynthesis of cyclodextrin glucosyltransferase and β -cyclodextrin by Bacillus macerans 314 and properties of the crude enzyme[J]. Biochem Eng J, 1996, 61: 247-253.

[7]NISHIDA T, NAKAMURA A, MASAKI H, et al. Regulation of cyclodextrin glucanotransferase synthesis in Bacillus ohbensis[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 149: 221-226.

[8]GAWANDE B N, PATKAR A Y. Purification and properties of a novel raw starch degrading-cyclodextrin glycosyltransferase from Klebsiella pneumoniae AS-22[J]. Enzyme Microb Technol, 2001, 28: 735-743.

[9]RAHMAN R A, ILLIAS R M, MOHD NAWAWI M G, et al. Optimisation of growth medium for the production of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus HR1 using response surface methodology[J]. Process Biochem, 2004, 39: 2053-2060.

[11]廖威, 華慧穎, 莫于旺. 一株β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的篩選與發(fā)酵條件研[J]. 廣西輕工業(yè), 20l1(2): l-3.

[12]何飛燕, 廖威, 莫于旺, 等. β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的雙重誘變育種[J]. 中國釀造, 2010(4): 154-158.

[13]汪偉明. 微生物誘變育種技術(shù): 離子注入法[J]. 科技信息(科學(xué)教研), 2007(20): 14-20.

[14]余增亮. 離子束生物技術(shù)引論[M]. 合肥: 安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1996: 137-222.

[15]姜紹通, 吳錦長, 楊培周, 等. 纖維素酶產(chǎn)生菌的誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(11): 192-197.

Screening of a High-Yield β-Cyclodextrin Glycosyltransferase-Producing Bacillus cereus Strain and Optimization of Its Fermentation Conditions

ZHANG Hong-bin，LING Guo-qing，HU Xue-qin，F(xiàn)AN Ning
(Department of Pharmaceutical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Bacillus cereus BC-0801, a β-cyclodextrin glycosyltransferase (β-CGTase)-producing strain, was mutagenized by means of low energy (10 keV) N+ion implantation at a dose of 40 × 2.5 × 1013ions/cm2to obtain a high-yield mutant strain designated as BC-0802. The effects of carbon and nitrogen sources and inorganic salt (K2HPO4) in the medium on β-CGTase production by BC-0802 were investigated by one-factor-at-a-time method. The three components were optimized by orthogonal array design method. The optimal fermentation medium was composed of corn flour 30 g/L, yeast extract 15 g/L, K2HPO4 1 g/L. The optimal fermentation conditions were determined as inoculum size 2%, fermentation period 36 h, temperature 30 ℃, and pH 9.0. The average β-CGTase activity of the mutant strain was 3415.8 U/mL (n = 5), which was 3.67 times higher than that of the starting strain. Moreover the mutant strain showed good genetic stability.

N+ion implantation；β-cyclodextrin glycosyltransferase；screening；mutagenesis；technological optimization

Q815

A

1002-6630(2012)15-0239-07

2012-03-23

安徽省長三角科技聯(lián)合攻關(guān)項目(10140702001)；合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(2012CXCY467)

張洪斌(1970—)，男，教授，博士，研究方向為生物酶工程。E-mail：zhb5678@163.com