趙 潔，徐 斐*，曹 慧，于勁松

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

水溶性有機溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響

趙 潔，徐 斐*，曹 慧，于勁松

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

從新鮮雞肝中提取出雞肝酯酶，并研究水溶性有機溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響。結(jié)果表明：甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇-甲醚、乙二醇-乙醚在低體積分數(shù)時對雞肝酯酶酶活力有激活作用，高體積分數(shù)使其失活。乙二醇-甲醚能夠較好的保持雞肝酯酶活力，當體積分數(shù)達到50%時，相對酶活力仍保持93%。丙酮和1,4-二氧六環(huán)對雞肝酯酶主要表現(xiàn)為失活作用，當體積分數(shù)達到10%時，相對酶活力低于80%。

雞肝酯酶；酶活力；水溶性有機溶劑

雞肝酯酶是一種由上海理工大學食品質(zhì)量與安全研究所從雞肝中提取的動物酯酶，是用于農(nóng)藥殘留快速檢測儀中的檢測工具酶，目前已有關(guān)于雞肝酯酶用于多種有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測的報道[1-3]。在農(nóng)藥速測過程中，利用有機溶劑提取農(nóng)藥是關(guān)鍵步驟之一，而有機溶劑的存在會對酶活力產(chǎn)生影響，進而影響檢測效果，因此研究有機溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響尤為重要[4]。本實驗以雞肝酯酶液酶為研究對象，研究幾種常用的水溶性有機溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響，以期為今后選取農(nóng)藥提取劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞肝 上海沔青食品廠；固蘭B(fast blue-salt)美國Sigma公司；α-乙酸萘酯(色譜純)、檸檬酸、檸檬酸三鈉、十二烷基硫酸鈉、丙酮、甲醇、無水乙醇、正丙醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、1,4-二氧六環(huán)均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型組織搗碎機 上海標本模型廠；超高速冷凍離心機 美國Beckman公司；722S型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；水浴搖床 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；超聲波清洗器 上?？茖С暡▋x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞肝酯酶的分離提取

將30.0g新鮮雞肝和90.0g的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(0.025mol/L的緩沖溶液，pH6.4)以1:3的比例混合，用組織搗碎機將上述混合物打成勻漿，為避免搗碎過程中溫度過高失去酶活力，先加入1/3的緩沖液進行搗碎，待雞肝全部粉碎后，再加入剩余2/3緩沖液，每旋轉(zhuǎn)10s，停20s。重復5次。所得勻漿在冷凍離心機上以4℃、4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，上清液即為雞肝酯酶，用脫脂棉過濾后，立即于－18℃凍藏備用。

1.3.2 雞肝酯酶酶活力的測定

根據(jù)van Asperen[5]所述方法改進，參考徐斐等[2]對雞肝酯酶液酶酶活力的檢測方法，具體方法如下：將酶液用pH6.4的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液適當稀釋。在2.5mL稀釋酶液中加入50μ L底物(16mmol/Lα-乙酸萘酯的丙酮溶液)混合均勻，在30℃恒溫水浴中保溫反應(yīng)5min，然后與0.5mL顯色劑(0.4%固蘭B的1.8% SDS溶液)混合均勻，再于30℃條件下保溫5min。以不加酶液的反應(yīng)液作空白，記錄595nm波長處的吸光度，根據(jù)下式計算雞肝酯酶液的活力。

式中：EL為酶液的雞肝酯酶酶活力/(U/mL)；D為酶液的稀釋倍數(shù)；K為α-萘酚標準曲線的斜率(10-6mol/L)；A為反應(yīng)液的吸光度。

1.3.3 有機溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響

選擇甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、1,4-二氧六環(huán)、乙二醇-甲醚、乙二醇-乙醚等水溶性有機溶劑為效應(yīng)物，在3mL的測定體系中，加入不同體積分數(shù)的效應(yīng)物，測定酶活力。以原來測得的酶活力記為E0，加入有機溶劑后測得的酶活力記為E1，用相對酶活力E1/E0分析研究效應(yīng)物對雞肝酯酶酶活力的影響。

同時，以不含羥基的乙醚為效應(yīng)物，測定相對酶活力，以此作為對照實驗，分析醇類、含羥基醚類有機溶劑在低體積分數(shù)條件下激活雞肝酯酶酶活力的原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 一元醇對雞肝酯酶酶活力的影響

圖1 3種一元醇對雞肝酯酶酶活力的影響Fig.1 Effects of methanol, alcohol and propanol on the activity of chicken liver esterase

由圖1可知，3種水溶性一元醇對雞肝酯酶的效應(yīng)均表現(xiàn)為先激活后抑制作用，其中以正丙醇對雞肝酯酶酶活力影響最為明顯，當體積分數(shù)為5%時對酶活力的激活作用達到最大，隨后迅速下降，25%時酶活力完全喪失。乙醇低于25%時對酶活力有激活作用，且該作用相對較平緩，隨乙醇體積分數(shù)升高變化不大；以25%為分界，高于25%雞肝酯酶酶活力迅速下降，當乙醇到達40%時，酶活力完全喪失。甲醇為40%時仍然能夠保持原酶活力的120%。從3種醇類對酶活力的影響推斷該影響可能與碳鏈長短有關(guān)。

2.2 2種含羥基醚對雞肝酯酶酶活力的影響

圖2 2種含羥基醚對雞肝酯酶酶活力的影響Fig.2 Effects of EGME and glycol ether on the activity of chicken liver esterase

由圖2可知，乙二醇-乙醚和乙二醇-甲醚對雞肝酯酶酶活力都表現(xiàn)為先激活后抑制作用，且體積分數(shù)在20%～25%區(qū)間激活作用達到最高值，在40%內(nèi)都能較好的保持酶活力。不同的是，乙二醇-乙醚大于40%后開始對酶活力產(chǎn)生抑制作用，到體積分數(shù)為50%時酶活力僅剩20%；而乙二醇-甲醚在體積分數(shù)為50%時仍保持較好的酶活力，相對酶活力約為100%。

2.3 丙酮、1,4-二氧六環(huán)對雞肝酯酶酶活力的影響

圖3 丙酮、1,4-二氧六環(huán)對雞肝酯酶酶活力的影響Fig.3 Effects of acetone and 1,4-dioxane on the activity of chicken liver esterase

由圖3可知，丙酮和1,4-二氧六環(huán)對雞肝酯酶酶活力的影響類似，多數(shù)情況下表現(xiàn)為抑制作用。丙酮體積分數(shù)小于5%時表現(xiàn)出輕微激活作用，隨后隨著體積分數(shù)升高，酶活力迅速下降。1,4-二氧六環(huán)體積分數(shù)小于5%時能夠保持酶活力在90%以上，但是高于5%后酶活力隨1,4-二氧六環(huán)體積分數(shù)升高而迅速下降。

2.4 不含羥基醚(乙醚)溶劑對雞肝酯酶酶活力的影響

圖4 乙醚對雞肝酯酶酶活力的影響Fig.4 Effect of glyeol ether on the activity of chicken liver esterase

由圖4可知，乙醚在體積分數(shù)低于25%時對雞肝酯酶酶活力表現(xiàn)為抑制作用，隨著體積分數(shù)升高，酶活力逐漸降低。低體積分數(shù)條件下，乙醚呈油狀小顆粒形態(tài)均勻分布在體系中，對雞肝酯酶酶活力并無激活作用，與含羥基醚類相比較作用完全不同，推斷可能與分子結(jié)構(gòu)中的羥基有關(guān)。

3 討 論

本實驗表明，正丙醇、乙醇、甲醇、乙二醇-乙醚、乙二醇-甲醚、丙酮、1,4-二氧六環(huán)有機溶劑對雞肝酯酶酶活力具有低體積分數(shù)激活、高體積分數(shù)抑制的作用。雞肝酯酶與多數(shù)酶一樣，在有機溶劑-水體系中可以發(fā)揮作用，而且在不同的有機溶劑中會表現(xiàn)出不同的催化活性；同一種溶劑中不同體積分數(shù)對雞肝酯酶酶活力的影響不同[6-10]。在以上實驗基礎(chǔ)上，對雞肝酯酶酶活力在有機溶劑-水體系中的變化及可能的原因做初步探討。

3.1 有機溶劑種類對雞肝酯酶酶活力的影響

醇類、含羥基醚類對雞肝酯酶酶活力的作用表現(xiàn)為先激活后抑制作用，而丙酮、1,4-二氧六環(huán)對酶活力的作用則以抑制為主、僅在體積分數(shù)極低的情況下表現(xiàn)出輕微的激活；而不含羥基的醚溶劑乙醚對酶活力不具有激活作用，主要表現(xiàn)為抑制作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，推測醇和醚中所含的羥基可能對激活雞肝酯酶的酶活力起主要作用?；衔镏兴牧u基結(jié)構(gòu)不僅能夠通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連，又能夠通過氫鍵與體系中的水相連，使酶的蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，酶活性得到保護，不致于受到溶劑奪取酶分子所含的結(jié)合水而失活[11-13]。而丙酮、1,4-二氧六環(huán)分子結(jié)構(gòu)中無羥基結(jié)構(gòu)，對雞肝酯酶酶活力作用表現(xiàn)為抑制作用，可能與溶劑本身結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3.2 雞肝酯酶對一元醇的耐受性

研究一元醇對雞肝酯酶酶活力的影響時，發(fā)現(xiàn)雞肝酯酶處于低體積分數(shù)的甲醇、乙醇溶劑中酶活力增加。只有當這兩種有機溶劑的體積分數(shù)升高到一定程度時，酶活力才逐漸受到抑制。這與國內(nèi)學者黃小紅等[8-9]研究甲醇、乙醇對其他酶活力的影響結(jié)果一致。不同的是，黃小紅等研究的甲醇、乙醇對棉鈴蟲N-乙酰氨基葡糖苷酶和Bt幾丁質(zhì)酶活力影響結(jié)果顯示，兩種酶酶活力下降50%時甲醇、乙醇的體積分數(shù)為25%，而本實驗中引起雞肝酯酶酶活力損失50%的甲醇、乙醇體積分數(shù)分別為50%、35%，均比前者高。這說明雞肝酯酶與其他酶相比，對甲醇、乙醇的耐受性較高。

3種一元醇對雞肝酯酶酶活力的失活作用以正丙醇最明顯，乙醇次之，甲醇第三，出現(xiàn)這種情況可能與碳鏈長短有關(guān)。碳鏈越長，溶劑中羥基的相對含量較少，所引起介質(zhì)中的介電常數(shù)相對較低，對酶活力保護作用較弱，酶也越容易失活，因此，3種醇中正丙醇對雞肝酯酶酶活力的影響最大[14]。

3.3 有機溶劑體積分數(shù)對雞肝酯酶活力的影響

雞肝酯酶酶活力在較高濃度有機溶劑中受到抑制作用，這是由于有機溶劑存在時雞肝酯酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化造成的[15]。酶分子中的疏水鍵對維持雞肝酯酶的三維結(jié)構(gòu)起著極其重要的作用，酶在水中以氫鍵、靜電力和疏水鍵等維持自身穩(wěn)定的三維構(gòu)象，并在酶分子表面形成一個極性水化層。當引入有機溶劑后，高濃度的有機溶劑可能通過破壞水化層，使雞肝酯酶酶分子中維系構(gòu)象的次級鍵被破壞，從而改變該酶的構(gòu)象，引起酶活力的下降。Griebenow等[16]用FTR定量地研究蛋白質(zhì)在有機溶劑-水混合體系中的二級結(jié)構(gòu)，測定溶菌酶和枯草桿菌蛋白酶在3種不同體積分數(shù)的水溶性有機溶劑(乙腈、四氫呋喃、正丙醇)中的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著體積分數(shù)上升，在60%的混合溶液中兩種酶的α折疊含量明顯減少。這說明隨著溶液中有機溶劑體積分數(shù)的增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到越嚴重的破壞，酶失活的趨勢增加，這也可能是有機溶劑影響雞肝酯酶酶活力的方式。

3.4 溶液極性對雞肝酯酶酶活力的影響

有研究表明，有機溶液濃度越高，溶液極性越小，酶活力隨之減小[17]。溶液極性對雞肝酯酶酶活力的影響可能為：酶的帶電基團與極性基團一般分布在酶的表面上，非極性疏水基團包埋于酶內(nèi)部，在極性較強的水溶液中，其處于熱力學穩(wěn)定狀態(tài)(即能量最低狀態(tài))。由于熱運動，雞肝酯酶在水溶液中的構(gòu)象存在著漲落與呼吸，可使酶內(nèi)部的非極性疏水基團翻到表面[18-19]。翻出作用是一種熱力學非自發(fā)過程，需要很高的活化能，因此雞肝酯酶處于動態(tài)平衡中，內(nèi)部的非極性疏水基團翻出機率很小。當水溶液中加入有機溶劑使溶液極性降低時，酶的穩(wěn)定性降低，雞肝酯酶內(nèi)部的非極性疏水基團翻出到表面上所需的活化能減小，翻出機率增大，從而使酶的活力降低[20]。

有機溶劑水溶液中當濃度較低時，雞肝酯酶酶活力受到激活，對于這種現(xiàn)象可能是由于雞肝酯酶在極性有微弱降低的體系中，內(nèi)部的非極性疏水基翻到表面上的機率適當增大，酶柔性增加所致。而雞肝酯酶柔性增加，活力提高，酶的活力有所激活[21]。

有機溶劑對酶活力的影響是酶工程研究的一個重要的領(lǐng)域。研究雞肝酯酶在有機溶劑-水體系中的活力變化，對建立新的雞肝酯酶檢測農(nóng)藥體系，選擇最佳有機溶劑作為農(nóng)藥提取劑與反應(yīng)介質(zhì)等，都具有重要的科研價值。

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Effects of Water-Soluble Organic Solvents on Activity of Chicken Liver Esterase

ZHAO Jie，XU Fei*，CAO Hui，YU Jin-song
(School of Medical Instrumentation and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093, China)

Chicken liver esterase, isolated from fresh chicken liver, is available for detecting pesticides. The effects of watersoluble organic solvents on the activity of chicken liver esterase were investigated. The results indicated that methanol, alcohol,propanol, ethylene glycol monomethyl ether (EGME) and glycol ether at low concentration could activate chicken liver esterase;in contrast, these organic solvents at high concentration could inactivate chicken liver esterase. Ethylene glycol monomethyl ether was the best organic solovent to maintain the activity of chicken liver esterase. When EGME concentration was 50%, the relative activity of chicken liver esterase remained 93%. Acetone and dioxane had negative effect on enzymatic activity. Acetone and dioxane at a concentration of 10% could result in 20% loss for relative activity of chicken liver esterase.

chicken liver esterase；enzymatic activity；organic solvents

TS201.6；TS201.2

A

1002-6630(2012)15-0216-04

2011-07-12

上海市科委生物醫(yī)藥專項(10391901500)；上海市農(nóng)委科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(2006第7-4號)

趙潔(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全快速檢測技術(shù)。E-mail：foxriver.fox@hotmail.com

*通信作者：徐斐(1972—)，女，教授，博士，研究方向為食品安全快速檢測技術(shù)。E-mail：xufei.first@263.net