佛手飲料廢渣中分離檸檬苦素的研究＊

檸檬苦素類化合物是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生代謝產(chǎn)物，有解痙攣與中樞抑制、保護心血管系統(tǒng)、抗過敏和抗炎等作用［3-8］.目前，傳統(tǒng)的分離檸檬苦素的方法主要是以柑橘屬植物為提取材料，使用大孔樹脂吸附法.但傳統(tǒng)分離方法用時長，分離效果受樹脂吸附作用的影響大［9-10］.而Sephadex LH-20凝膠柱能夠簡單、快捷、高效率地分離檸檬苦素［11-12］.本實驗首次以佛手飲料廢渣作為檸檬苦素的提取材料，使用Sephadex LH-20凝膠柱色譜進行分離純化，用核磁共振(NMR)方法進行結(jié)構(gòu)鑒定，并結(jié)合高效液相色譜(HPLC)法對檸檬苦素進行了定量測定.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

佛手飲料殘渣：浙江省金華市金佛手農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;檸檬苦素標準品：上海源葉生物科技有限公司;葡聚糖凝膠LH-20(Sephadex LH-20)：通用電氣(GE)公司;乙腈(色譜純);二氯甲烷(色譜純).其他試劑均為市售分析純.

色譜儀BioLogic DuFlow Pathfinder 80 System：Bio-Rad公司，美國;AV400傅立葉核磁共振波普儀：bruker公司，美國;DZF-6050B型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司;RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠;超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司.

1.2 檸檬苦素分離純化

取150 g佛手飲料廢渣，料液比為1∶3，熱水回流3 h后過濾，濾液依次用500 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各萃取部分及水溶液部分.取乙酸乙酯部分濃縮至浸膏，將浸膏真空干燥后得2 g檸檬苦素粗品，再用1.5 mL V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶1的混合溶劑溶解，得棕黃色樣品溶液.檸檬苦素分離純化流程見圖1.

1.3 凝膠柱色譜分離

將棕黃色樣品溶液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離純化.分離條件：檢測波長為360 nm;柱體積為112.5 mL，分離柱內(nèi)徑為1.5 cm;流動相為甲醇，流速為0.5 mL/min;進樣量為1 mL.采用部分收集器收集，每2 mL為1份，合并第43～59份，干燥得粉末7 mg.

圖1 檸檬苦素分離純化流程

1.4 高效液相色譜測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱為美國AGT Venusil XBP(L)ODS C18柱(250 mm × 4.6 mm，10 μm);流動相為V(乙腈)∶V(水)=45 ∶55 混合溶劑，流速為 0.8 mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為207 nm;進樣量為10 μL.測定樣品和標準品.

1.4.2 標準曲線的繪制

精確量取2 mg/mL檸檬苦素標準品溶液0.12，0.24，0.48，0.72，0.96 和 1.20 mL 至 6 個10 mL容量瓶中，分別用乙腈定容至刻度，制成一系列濃度梯度標準溶液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜進樣，記錄色譜圖.以峰面積為縱坐標、檸檬苦素標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=6 ×10－6X(R2=0.999 8).檸檬苦素含量在24～240 μg/mL線性關(guān)系良好.

1.4.3 樣品中檸檬苦素的定量

將粉末樣品用乙腈溶解并定容至50 mL，從中分別量取0.155，0.315，0.625 和 1.250 mL 稀釋至10 mL，標記為樣品 a，b，c 和 d.其中：c為經(jīng)HPLC測定樣品液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度(μg/mL);V為從50 mL乙腈溶解液中所取樣液量(mL);m為佛手飲料廢渣的質(zhì)量(g).

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠柱色譜分離結(jié)果

圖2 Sephadex LH-20柱色譜分離檸檬苦素

Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離檸檬苦素的出峰時間為225 min，收集該時段的樣品.Sephadex LH-20色譜分離結(jié)果如圖2所示.

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

無色顆粒狀結(jié)晶(氯仿)，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯，稍溶于甲醇.ESI(+)-MS，m/z：470［M+Na］+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)，δ：7.41(1H，m，H-21)，7.27(1H，s，H-23)，6.34(1H，s，H-22)，5.47(1H，s，H-17)，4.77(1H，d，J=13.1 Hz，H-19β)，4.46(1H，d，J=13.1 Hz，H-19α)，4.04(2H，brs，H-1 和 H-15)，2.99(1H，dd，J=16.7，3.5 Hz，H-2β)，2.85(1H，t，J=15.1 Hz，H-6β)，2.68(1H，dd，J=16.7，3.5 Hz，H-2α)，2.46(1H，d，J=13.5 Hz，H-6α)，2.24(1H，d，J=13.3 Hz，H-5)，2.56(1H，d，J=11.2 Hz，H-9)，1.18，1.17，1.07，1.05(各 3H，s).該數(shù)據(jù)與文獻［13］一致，故鑒定此化合物為檸檬苦素(limonin).核磁共振譜圖和檸檬苦素結(jié)構(gòu)式見圖3.

圖31H核磁共振譜圖

圖4 檸檬苦素的高效液相色譜圖

2.3 高效液相色譜測定結(jié)果

在色譜條件下，檸檬苦素的分離度高，峰形較好，保留時間為11 min左右，色譜圖中其他差異峰是由樣品中其他物質(zhì)引起的.檸檬苦素樣品和標準品的色譜圖見圖4.

2.4 樣品中檸檬苦素定量分析結(jié)果

根據(jù)標準曲線得出的線性回歸方程，用高效液相色譜法測定樣品中檸檬苦素的峰面積，計算得出檸檬苦素的含量(見表1).

表1 樣品中檸檬苦素含量的測定結(jié)果

2.5 方法精密度與重現(xiàn)性檢測結(jié)果

取一定質(zhì)量濃度的檸檬苦素標準溶液10 μL進樣，平行測定5次，以測得的檸檬苦素的峰面積為指標，計算相對標準偏差為0.9%(見表2).取同一批號的樣品溶液1份，進樣10 μL，以測得的檸檬苦素的峰面積為指標，計算相對標準偏差為1.1%(見表2).該結(jié)果表明方法的精密度與重現(xiàn)性均良好.

表2 檸檬苦素測定的精密度與重現(xiàn)性

3 結(jié)論

本文對佛手飲料廢渣有效成分檸檬苦素的提取進行了研究，建立了Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離、NMR方法進行結(jié)構(gòu)鑒定、高效液相色譜法測定檸檬苦素含量的方法.在此工藝條件下，測得佛手飲料廢渣中檸檬苦素含量為1.73 mg/g.綜合實驗結(jié)果可知，該方法分離測定佛手飲料廢渣中的檸檬苦素，可行性較強.如何產(chǎn)業(yè)化提取檸檬苦素并將提取后的佛手飲料廢渣綜合再利用，將是今后需重點關(guān)注與研究的方向.

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許杭琳， 鄧 剛， 焦聰聰， 孔黎春， 張藝馨， 黃群曉

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離純化了佛手飲料廢渣中的檸檬苦素，分離條件：檢測器波長為207 nm;柱體積為112.5 mL，分離柱內(nèi)徑為1.5 cm;流動相為甲醇，流速為0.5 mL/min.用核磁共振法對分離產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)鑒定.通過高效液相色譜法測定了佛手飲料廢渣中檸檬苦素的含量，測定條件：采用美國AGT Venusil XBP(L)ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，10 μm);流動相 V(乙腈)∶V(水)=45 ∶55，流速為 0.8 mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為207 nm.結(jié)果顯示，佛手飲料廢渣中檸檬苦素含量為1.73 mg/g，相對標準偏差為1.1%.

佛手;廢渣;檸檬苦素;葡聚糖凝膠LH-20;高效液相色譜

Extraction of limonin from residue of berganot juice

XU Hanglin， DENG Gang， JIAO Congcong， KONG Lichun， ZHANG Yixin， HUANG Qunxiao

(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

Limonin in waste residue of bergamot was separated by Sephadex LH-20 column chromatography，and the wavelength of detector was set to 207 nm;column volume was 112.5 mL，the diameter of column was 1.5 cm;with methanol as 100%mobile phase and flow rate flow rate was 0.5 mL/min，NMR was used to structural identification after the separation.HPLC was used to determine the quantity of limonin.Chromatographic conditions：American AGT Venusil XBP(L)ODS C18(250 mm ×4.6 mm，10 μm)column with acetonitrile-water，45 ∶55(V/V)as mobile phase and flow rate 0.8 mL/min.The column temperature was controlled at 25℃ and the wavelength of detector was set to 207 nm.The results showed that the RSD was 1.1%and the limonin content in waste residue of bergamot under those conditions reached 1.73 mg/g.

fingered citron;waste residue of bergamot;limonin;Sephadex LH-20;HPLC

TS209

A

2011-12-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(21006098);浙江師范大學(xué)創(chuàng)新科研項目(2010-2013)

許杭琳(1986－)，女，浙江金華人，碩士研究生.研究方向：植物生物技術(shù).

鄧 剛.E-mail：denggang@zjnu.cn

1001-5051(2012)03-0322-04

(責任編輯 薛 榮)

佛手(Citrus medica Linn.var.sarcodactylis(Noot))是蕓香科柑橘屬植物，佛手飲料廢渣是佛手飲料生產(chǎn)過程中的主要廢棄物，占佛手鮮果質(zhì)量的80%［1-2］.佛手鮮果的價格昂貴(人民幣24～30元/kg)，因此，佛手飲料廢渣每年造成的經(jīng)濟浪費和對環(huán)境造成的污染不容忽視.然而，目前對佛手飲料廢渣的開發(fā)利用手段極其有限.本研究發(fā)現(xiàn)，佛手飲料廢渣中仍含有大量的檸檬苦素類化合物，將其提取出來并加以利用，是提高佛手產(chǎn)業(yè)效益的重要途徑.