黃瑩波

廣東省水文局茂名水文分局，廣東 茂名 525000

浮游植物葉綠素a提取方法的改進(jìn)：反復(fù)凍融-浸提法

黃瑩波

廣東省水文局茂名水文分局，廣東 茂名 525000

傳統(tǒng)的分光光度法使用研磨法提取葉綠素a，操作過程易造成光降解，研磨、洗滌轉(zhuǎn)移過程損失大，操作復(fù)雜且不利于操作人員安全。本文對反復(fù)凍融－浸提法進(jìn)行了總結(jié)，說明了基本操作步驟和注意事項(xiàng)。該方法簡化了操作步驟提高效率，提高了分析方法的準(zhǔn)確度，更加安全。

反復(fù)凍融-浸提；浮游植物；葉綠素a；分光光度法；改進(jìn)

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藻類葉綠素a是表征水體初級生產(chǎn)力和藻類生物量的重要指標(biāo)，可以反映游植物生物量狀況及其變化趨勢，其濃度被廣泛應(yīng)用于水體富營養(yǎng)化評價和水華預(yù)警。分光光度法測定葉綠素a具有儀器設(shè)備成本低、葉綠素a易提取等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。水利部發(fā)布的葉綠素的測定（分光光度法）（SL88-1994）[1]主要分為濃縮、提取、離心和測定4個步驟。本文總結(jié)了步驟中研磨提取法的缺點(diǎn)，介紹了反復(fù)凍融-浸提法的原理、操作步驟及操作注意事項(xiàng)，通過比較實(shí)驗(yàn)對比了兩種方法的提取效率。

1. 傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)的分光光度法[1]是用研磨法來提取葉綠素a，其存在如下缺點(diǎn)：

1.1 易發(fā)生光降解

在研磨提取及測試過程中樣品接受光照機(jī)會大，葉綠素a 易發(fā)生光降解。為了比較在測定過程中不同光照條件對測定葉綠素a的影響，用丙酮提取過葉綠素的樣品分別放置于室外陽光、室內(nèi)自然光和微弱日光燈三種光照條件下，每隔一段時間測定其葉綠素a濃度，從而了解其降解情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉綠素a樣品在陽光下的降解速度最快，其次為室內(nèi)自然光。以上兩種光照條件造成葉綠素降解的原因[2]是，陽光中光譜范圍較寬，其中含有的紫外線對葉綠素有很強(qiáng)的破壞作用，藍(lán)光（430、470nm）、紅光（650nm）也使葉綠素發(fā)生降解。葉綠素的降解過程為一級動力學(xué)反應(yīng)，而且如果光強(qiáng)增大，也會加快葉綠素的降解。在微弱日光燈照射下降解速度較低，在較短時間內(nèi)測試樣品不會對結(jié)果造成明顯影響。

表1 不同光照條件下葉綠素a的降解情況

1.2 研磨、洗滌轉(zhuǎn)移過程損失大

葉綠素的提取經(jīng)過多次的研磨、洗滌、轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生了較大的人為誤差，平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。如果研磨操作進(jìn)行不充分，葉綠素的提取不完全，容易造成結(jié)果偏小。

1.3 操作復(fù)雜工作量大

提取過程步驟復(fù)雜，處理大量樣品時，逐個樣品的研磨和轉(zhuǎn)移過程耗費(fèi)大量時間和精力；

1.4 不利于身體健康

操作人員與揮發(fā)性強(qiáng)的丙酮溶液近距離、長時間接觸，不利于操作人員身心健康。

2.改進(jìn)方法——反復(fù)凍融-浸提法

針對研磨法的上述缺點(diǎn)，不少研究者提出了相應(yīng)的改進(jìn)方法。如許多研究表明，載有濃縮樣品的濾膜不經(jīng)過研磨，直接用90%丙酮進(jìn)行浸提，可以有效地減小葉綠素a的損失[3][4][5][6]，但浸提的方法各有不同。本文建議把葉綠素提取過程改為反復(fù)凍融-浸提法。反復(fù)凍融－浸提法通過反復(fù)凍融對植物細(xì)胞壁進(jìn)行破碎，再用丙酮溶液提取葉綠素a的方法。

2.1 反復(fù)凍融－浸提法原理

相對于傳統(tǒng)的分光光度法，反復(fù)凍融－浸提法改進(jìn)了藻類細(xì)胞壁破碎及葉綠素a的提取過程。該方法的破碎和提取原理[3][7]：將載有藻類細(xì)胞的濾膜置于-20℃環(huán)境下避光冰凍，造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成冰粒，引起細(xì)胞質(zhì)體變形致使細(xì)胞壁破裂；然后至于室溫條件下避光解凍，使葉綠素等內(nèi)含物溶出?？紤]到反復(fù)凍融對藻類細(xì)胞的破壁率受到不同細(xì)胞種類、同種藻類不同生長狀況的影響，可通過增加凍融次數(shù)和延長浸提時間來提高提取率。

2.2 反復(fù)凍融－浸提法的基本步驟

2.2.1 抽濾濃縮：通過孔徑為0.45μm的醋酸纖維濾膜過濾一定體積水樣，將藻類收集于濾膜上；將載藻濾膜對折兩次，裝進(jìn)小封口袋，然后放入黑色塑料袋；

凍融：將裝濾膜的黑色塑料袋置于-20℃下冰凍12小時；室溫下解凍(濾膜仍置黑色塑料袋內(nèi)避光)約5分鐘，直至濾膜變軟即可；在-20℃與室溫下反復(fù)凍融3～5 次，冰凍時間約20分鐘，解凍時間約為5分鐘；

2.2.2 浸提：將反復(fù)凍融后的濾膜放入盛有10mL 丙酮（90%）的離心管中，避光條件下振搖1分鐘，直至濾膜完全溶解；將離心管放置冰箱(4℃)中浸提20 小時，浸提過程中需取出避光振搖1～2 次；

2.2.3 離心：將離心管于4000r/m條件下離心15min；

2.2.4 測定：在630、645、663、750nm波長處測定離心管上清液的吸光度；

2.3 反復(fù)凍融－浸提法操作注意事項(xiàng)：

2.3.1 由于反復(fù)凍融-浸提法是利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶脹來達(dá)到破碎細(xì)胞的目的，因此抽慮后的濾膜應(yīng)保留少許水分，防止藻細(xì)胞失水；

2.3.2 對折濾膜時應(yīng)將含有葉綠素的部分向內(nèi)；

2.3.3 濾膜的冰凍和融解的時間不宜太長，1次冰凍和融解的時間比例大概為20min/5min，待濾膜變軟即可；

2.3.4 在所有步驟過程中需嚴(yán)格避光。如需要在有光線情況下操作，應(yīng)在微弱的日光燈下，以減少葉綠素a的光降解；

2.3.5 750nm的吸光度在0.005以上時，表明90%丙酮溶液濁度較高，應(yīng)將溶液再一次充分地離心分離，然后再測定其吸光度。

3. 比較實(shí)驗(yàn)

用不同濃度的水庫水樣分別用研磨法和反復(fù)凍融－浸提法進(jìn)行測定，其葉綠素a測定結(jié)果見1，表2和圖1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反復(fù)凍融－浸提法所測得的葉綠素a 濃度水平較研磨法高18-59%，說明了反復(fù)凍融－浸提法對葉綠素a的提取效率明顯高于研磨法。

表2 研磨法和反復(fù)凍融－浸提法比較實(shí)驗(yàn)

圖1 研磨法和反復(fù)凍融－浸提法比較實(shí)驗(yàn)

4. 結(jié)語

凍融-浸提法有以下優(yōu)點(diǎn)：

4.1 凍融-浸提法大大減少了操作過程光照的時間，降低了葉綠素的光降解；避免了研磨和樣品轉(zhuǎn)移過程中葉綠素a 的損耗，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確；

4.2 濾膜不需經(jīng)過研磨，用丙酮溶液浸提后的樣品濁度低，750nm波長的吸光度容易達(dá)到0.005；

4.3 不用逐一研磨，可以同時處理大批量的樣品，并且操作簡單，提高了效率；

4.4 操作者不必長時間暴露于丙酮溶液揮發(fā)氣體中，更加安全。

通過把葉綠素a的提取步驟改進(jìn)為反復(fù)凍融-浸提法，簡化了操作步驟提高效率，提高了分析方法的準(zhǔn)確度，更加安全。

[1] 水質(zhì)分析方法,SL88-1994[S].北京:中華人民共和國水利部,1995.

[2] 黃持都,陳計巒,胡小松,等.光對采后果蔬葉綠素降解動力學(xué)研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報.2008,24(10):233-238.

[3] 林少君, 賀立靜, 黃沛生, 等. 浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進(jìn)[J]. 生態(tài)科學(xué)，2005, 24(1):9-11.

[4] 韓桂春,谷豐,張忠臣.淡水中葉綠素a測定方法的探討[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2005,21(1):55-57.

[5] 翁笑艷,林美愛,嚴(yán)穎.地表水浮游植物葉綠素a測定方法比較研究[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2009,25(3):36-38.

[6] 唐曙暇.改進(jìn)淡水中葉綠素a測定方法的探討[J].江淮水利科技,2006,(5):40-41.

[7] 孫利芹,王長海,江濤.紫球藻細(xì)胞破碎方法研究[J].海洋通報, .2004，23(4):1-4.

黃瑩波，1981年10月出生，男，壯族，廣西馬山縣人，工程師，大學(xué)本科學(xué)歷，主要從事水質(zhì)監(jiān)測與評價工作。工作單位為廣東省水文局茂名水文分局。

10.3969/j.issn.1001-8972.2012.10.098