延 莎，張紅城，董 捷*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部國(guó)家蜂產(chǎn)品加工專(zhuān)業(yè)分中心，北京 100093)

不同植物源蜂膠揮發(fā)性成分差異分析

延 莎，張紅城，董 捷*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部國(guó)家蜂產(chǎn)品加工專(zhuān)業(yè)分中心，北京 100093)

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析4種不同植物來(lái)源的蜂膠揮發(fā)性成分，并結(jié)合主成分分析法對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同植物源的蜂膠揮發(fā)性成分存在差異，主要表現(xiàn)在共有組分的含量和特有組分兩個(gè)方面。其中的共有組分有3-甲基-3-丁烯-1-醇、異戊二烯、4-戊烯-1-乙酸酯、梨醇酯、4-異丙基甲苯、檸檬烯、桉葉油醇、3-蒈烯、壬醛、α-古巴烯、α-依蘭油烯、去氫白菖烯、β-馬欖烯、β-桉葉醇和α-桉葉醇，它們?cè)诟鳂悠分械暮肯嗖钶^大。特有組分，如：樣品a，α-松油烯、α-柏木烯；樣品c，α-姜黃烯、α-愈創(chuàng)木烯；樣品d，石竹烯、γ-依蘭油烯、苯甲酸芐酯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有利于提取蜂膠的特征信息，進(jìn)行指紋圖譜及區(qū)分模型的研究。

蜂膠；膠源植物；揮發(fā)性成分；固相微萃取；主成分分析

蜂膠是蜜蜂將采自植物的枝條、葉芽及愈傷組織等的分泌物與上腭腺、臘腺等的分泌物同少量花粉混合后所形成的黏性物質(zhì)[1]。大量研究已經(jīng)證明，蜂膠具有多種藥理作用，抑菌、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、保肝、抗氧化和抗腫瘤等[2]。有報(bào)道指出，蜂膠的化學(xué)組成及功能特性與當(dāng)?shù)氐闹参镌聪⑾⑾嚓P(guān)[3-4]。蜂膠中的化學(xué)成分由揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分共同組成，其中的一些揮發(fā)性成分形成了蜂膠獨(dú)特的氣味，可作為一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)，具有指紋特征[5]。以往，研究者習(xí)慣于比較不同產(chǎn)地蜂膠的揮發(fā)性成分，如，Melliou等[6]研究了希臘5個(gè)不同地區(qū)的蜂膠揮發(fā)性成分，結(jié)果表明所有樣品揮發(fā)性成分的組成主要是萜類(lèi)化合物，尤其是α-蒎烯。在國(guó)內(nèi)，也有一些研究者對(duì)不同產(chǎn)地的蜂膠揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，曾晞等[7]用氣相色譜-質(zhì)譜法分析比較了貴州兩個(gè)產(chǎn)地的蜂膠揮發(fā)油化學(xué)成分，結(jié)果表明兩地蜂膠所含揮發(fā)油種數(shù)相近，成分有一定差異但不大。但是，來(lái)源產(chǎn)地的差異無(wú)法反映出不同蜂膠樣品本質(zhì)上的差異，因?yàn)槟z源植物才是決定蜂膠差異的更為重要的因素。本實(shí)驗(yàn)利用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(headspace-solid phase microextraction-gas chroma-tography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分析4 種不同植物來(lái)源的蜂膠樣品，并結(jié)合主成分分析法對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，以期為蜂膠質(zhì)量評(píng)價(jià)及其標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛膠樣品由國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的專(zhuān)家通過(guò)當(dāng)?shù)氐姆錁I(yè)推廣站直接提供，膠源信息見(jiàn)表1。

表1 蜂膠樣品的產(chǎn)地及主要膠源植物Table 1 Original regions and plant sources of propolis samples

1.2 儀器與設(shè)備

PL303電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；7890A GC/5975C MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent 公司；中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；手動(dòng)固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS萃取纖維(2cm-50/30μm) 美國(guó)Supelco公司；FDB02DD型加熱器 英國(guó)Techne公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠原料前處理

毛膠剔除雜質(zhì)后放入冷凍柜冷凍4h以上，取出后迅速放入中草藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩備用。

1.3.2 蜂膠揮發(fā)性成分的提取

對(duì)萃取時(shí)間、萃取溫度和萃取頭3個(gè)固相微萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維，55℃萃取45min為最適宜萃取條件。

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g蜂膠樣品，置于15mL頂空瓶中，55℃平衡15min，然后將裝有萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器插入頂空瓶中(萃取頭使用前根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行老化)，55℃頂空吸附45min，260℃解吸5min。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30m×250μm，0.25μm)；初始溫度40℃，保持3min，5℃/min升溫到200℃，保持1min，再以12℃/min升至260℃，保持1min。進(jìn)樣口溫度：260℃；載氣He，流速1.0mL/min；5∶1 分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式EI；電子能量70eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；掃描質(zhì)量范圍45～550u。各組分經(jīng)過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索和Wiley譜庫(kù)相匹配。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)面積歸一法得到每種揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。利用Alpha MOS公司的電子鼻自帶數(shù)據(jù)處理軟件，版本12.3，以在不同保留時(shí)間流出的化合物作為不同指標(biāo)，對(duì)4個(gè)樣品各組分的相對(duì)含量，12組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)結(jié)果

圖1 HS-SPME-GC-MS法測(cè)定樣品c揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current of volatile components in propolis determined by HS-SPME-GC-MS

通過(guò)HS-SPME-GC-MS法得到的蜂膠揮發(fā)性成分的總離子流圖(樣品c)見(jiàn)圖1，各樣品主要的揮發(fā)性成分及根據(jù)面積歸一法得到的相對(duì)含量見(jiàn)表2。膠源植物主要為黨參的蜂膠樣品根據(jù)保留時(shí)間共得到66個(gè)組分，占總組分的97.5073%，其中3-甲基-2-丁烯醛(5.133%)、苯甲醛(5.1179%)、α-柏木烯(9.5903%)、β-馬欖烯(6.7502%)、β-桉葉醇(7.2866%)和α-桉葉醇(6.025%)含量較高；主要膠源植物為楊樹(shù)的蜂膠樣品共得到68個(gè)組分，占到總組分的96.9488%，其中苯甲醇(13.4731%)、壬醛(4.6823%)、苯甲酸(10.7157%)、α-紫穗槐烯(5.1566%)、β-桉葉醇(5.0611%)和α-桉葉醇(5.6298%)相對(duì)含量較高；主要膠源植物為毛栗子、五蓓子和漆樹(shù)的蜂膠樣品共得到74個(gè)組分，占總組分的97.1627%，其中苯乙烯(3.5063%)、苯甲醛(17.7887%)、桉葉油醇(3.7663%)、苯甲醇(19.4435)和壬醛(6.0427%)相對(duì)含量較高；主要膠源植物為椴樹(shù)、松樹(shù)和楊樹(shù)的蜂膠樣品得68個(gè)揮發(fā)性組分，占總組分的98.613%，其中苯甲醛(11.2215%)、苯甲醇(27.8108%)的含量顯著高于此樣品中的其他組分。

表2 不同植物源蜂膠各揮發(fā)性成分組成及其相對(duì)含量Table 2 Chemical compositions and relative contents of volatile components in propolis samples from different plant sources

續(xù)表2

2.2 主成分分析結(jié)果

表3 主成分的累積方差貢獻(xiàn)率Table 3 Cumulative proportion of principal components

圖2 不同植物源蜂膠主成分分析結(jié)果Fig.2 PCA results of propolis samples from different plant sources

如表2所示，通過(guò)HS-SPME-GC-MS所檢測(cè)到的蜂膠揮發(fā)性組分很多，很難從中明顯地發(fā)現(xiàn)不同植物源蜂膠樣品之間的差異程度。主成分分析的中心目的是將數(shù)據(jù)降維，以排除眾多化學(xué)信息共存中相互重疊的信息。它是將原變量進(jìn)行轉(zhuǎn)換，使少數(shù)幾個(gè)新變量成為原變量的線(xiàn)性組合，同時(shí)，這些變量要盡可能多地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征而不丟失信息。新變量互不相關(guān)，即正交[8-9]。如表2所示，第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為69.737%，第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為20.343%，前兩個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為90.08%，故前兩個(gè)主成分基本反映了所有數(shù)據(jù)的信息量(90.08%＞80%)。

通過(guò)主成分分析，將原有的131個(gè)組分，減少到2個(gè)主成分，從而使引起不同植物源蜂膠揮發(fā)性成分差異的多維數(shù)據(jù)降到二維，差異更加明顯化。利用這種數(shù)據(jù)處理方法，可以進(jìn)一步建立不同植物源蜂膠的識(shí)別模式。對(duì)4種不同植物源的蜂膠主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖2，識(shí)別指數(shù)(DI)達(dá)到97(滿(mǎn)分為100)，表明這4種蜂膠樣品差異較大，通過(guò)PCA能將其區(qū)分開(kāi)。

式中：Si代表各組樣本的表面積；S總代表所有樣本的總面積。

結(jié)合原始數(shù)據(jù)與主成分分析結(jié)果，在所列的區(qū)分四種蜂膠樣品的揮發(fā)性成分中，其中的共有組分有3-甲基-3-丁烯-1-醇、異戊二烯、4-戊烯-1-乙酸酯、梨醇酯、4-異丙基甲苯、檸檬烯、桉葉油醇、3-蒈烯、壬醛、α-古巴烯、α-依蘭油烯、去氫白菖烯、β-馬欖烯、β-桉葉醇和α-桉葉醇，它們?cè)诟鳂悠分械暮肯嗖钶^大。還有一些組分是某樣品的特有組分，如：樣品a，17.304minα-松油烯，27.948minα-柏木烯；樣品c，25.077minα-姜黃烯，27.826minα-愈創(chuàng)木烯；樣品d，23.547min石竹烯，28.779minγ-依蘭油烯，31.505min苯甲酸芐酯。這些組分信息可能是區(qū)分不同膠源植物的特征信息。

3 討 論

利用SPME技術(shù)富集蜂膠中的揮發(fā)性成分，再進(jìn)行GC-MS分析，方便、快捷、不消耗溶劑[10-11]，有利于提取蜂膠揮發(fā)性成分中的特征信息。4種蜂膠樣品的揮發(fā)性成分都由酸、醇、酯及烴類(lèi)化合物構(gòu)成，尤其是萜烯類(lèi)化合物種類(lèi)較多。Melliou等[6]指出希臘蜂膠抑菌活性可能與主要成分α- 蒎烯有關(guān)，徐響等[12]研究也發(fā)現(xiàn)蜂膠的揮發(fā)油具有抑菌作用。Popova等[13]用GC-MS分析和鑒別地中海不同地區(qū)蜂膠樣品中的二萜類(lèi)化合物，并指出二萜類(lèi)化合物的色譜和質(zhì)譜鑒別，對(duì)于快速地構(gòu)建蜂膠類(lèi)型和了解其植物來(lái)源是非常有利的。本研究中所得的化合物組成與Yang等[14]報(bào)道的較為相似，但與徐響等[15]報(bào)道的北京延慶和河北唐山兩地蜂膠揮發(fā)性成分的主要貢獻(xiàn)化合物有差異，這很可能是由于地理位置的不同，或者膠源植物的不同所引起的。

主成分分析結(jié)果表明，植物源是影響蜂膠揮發(fā)性成分差異的主要因素。a和c蜂膠樣品都是來(lái)自甘肅省，b蜂膠樣品和d蜂膠樣品分別來(lái)自遼寧喀則和吉林敦化，但分析結(jié)果表明沒(méi)有因?yàn)榈乩砦恢玫南嘟涮匦韵嘟?，反而是樣品c和樣品d的特性較為相近。結(jié)合主成分分析結(jié)果與原始數(shù)據(jù)，一方面可以從蜂膠的揮發(fā)性成分中提取共有的特征信息，建立指紋圖譜；另一方面可以辨出不同植物源蜂膠的特有信息，幫助快速準(zhǔn)確的識(shí)別植物源。

本研究用HS-SPME-GC-MS分析4種不同植物源蜂膠的揮發(fā)性成分，其構(gòu)成主要是醇、酯及烴類(lèi)化合物，尤其是萜烯類(lèi)化合物種類(lèi)較多，不同植物源的蜂膠其含量相對(duì)較高的化合物類(lèi)型并不相同。結(jié)合主成分分析，不同植物源的蜂膠樣品揮發(fā)性成分確實(shí)有差異，且造成差異的因素一是共有組分的含量差異，另一方面是特有組分的顯示，這些結(jié)果有利于提取其特征信息，進(jìn)行指紋圖譜及區(qū)分模型的研究。

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Difference in Volatile Compounds of Propolis from Different Plant Sources

YAN Sha，ZHANG Hong-chenge，DONG Jie*
(National Research Center of Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Propolis is a sticky dark-colored material. Its pharmacological activity and chemical compositions are highly variable,which depends on the plant sources. Solid phase microextraction coupled with GC-MS was used to analyze the volatile compounds in propolis from 4 types of plant sources. The results of principal component analysis (PCA) revealed the difference of volatile compounds in different plant sources. The same components included 3-methyl-3-butene-1-ol, isoprene,4-pentene-acetate, prenyl acetate, 4-cymene, limonene, cineole, 3-carene, nonanal,α-cubaene,α-muurolene,β-eudesmol andα-eudesmol. This study will provide a theoretical reference for further investigation of fingerprints and distinguish diagram of propolis.

propolis；plant source；volatile compounds；solid phase microextraction (SPME)；principal component analysis (PCA)

S896

A

1002-6630(2012)10-0268-06

2011-05-06

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-45-KXJ18)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD33B04)

延莎(1986—)，女，碩士研究生，主要從事功能食品研究。E-mail：yansha052@126.com

*通信作者：董捷(1966—)，女，研究員，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：jiedon@126.com