索 標(biāo)，滕要輝，史賢明，艾志錄

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

食品中熱損傷沙門氏菌選擇性增菌及實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測

索 標(biāo)1,2，滕要輝1，史賢明2，艾志錄1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

為了能夠高效檢測食品中的亞致死損傷沙門氏菌，首先采用熱激脅迫的方法得到亞致死損傷沙門氏菌細(xì)胞，進而基于選擇性增菌培養(yǎng)液SEL建立一種實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測技術(shù)。結(jié)果表明：在SEL中經(jīng)過20h增菌培養(yǎng)后，無論是否經(jīng)過修復(fù)培養(yǎng)，1～2CFU/5mL SEL的亞致死損傷細(xì)胞都能得到完全修復(fù)并增菌至109CFU/mL水平；依此建立的實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測技術(shù)的純菌擴增效率為95.41%，檢測限為4CFU/反應(yīng)體系，在人工污染碎食品樣品中的檢測限為3CFU/10g碎牛肉，而且與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法的結(jié)果相吻合。本方法在24h內(nèi)即可完成食品中熱損傷沙門氏菌的修復(fù)、選擇性增菌以及實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，可應(yīng)用于食品中沙門氏菌污染狀況調(diào)查及高效檢測。

熱損傷；沙門氏菌；選擇性增菌；實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測

沙門氏菌(Salmonella)是一種廣泛分布于自然界的危害極大的腸道致病菌，在我國，40%的細(xì)菌性食物中毒病例是由沙門氏菌引起的[1]，因此必須采取高效的檢測手段以保障食品的安全。實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法是檢測微生物的有效分子手段之一[2]，現(xiàn)在已經(jīng)建立一些實時熒光PCR檢測技術(shù)以用于食品中沙門氏菌的檢測[3]。

食源性致病菌經(jīng)過熱激等物理控制方法處理后會出現(xiàn)3種生理上狀態(tài)不同的細(xì)胞——未受損傷的細(xì)胞、亞致死損傷細(xì)胞和死亡細(xì)胞[4]。由于食品中亞致死損傷細(xì)胞存在的可能性，新型分子檢測技術(shù)的開發(fā)需要能夠同時檢出活性細(xì)胞和損傷細(xì)胞[5]。此外，絕大多數(shù)食品樣品中的致病菌都是以很低的水平存在(每25g食品一般只有1～2個細(xì)胞)，食品樣品中也存在大量的背景微生物菌群，因此，在檢測之前仍需要對食品中的致病菌進行選擇性增菌培養(yǎng)[6]。然而，目前常用的作為選擇性培養(yǎng)基的成分對損傷致病菌的修復(fù)和生長會產(chǎn)生抑制作用[7]，這也是目前食源性致病菌檢測之前，大都需要經(jīng)過非選擇性修復(fù)培養(yǎng)后再經(jīng)過選擇性增菌這兩步的主要原因[8]。SEL是Kim等[9]開發(fā)出來的用于沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7以及單核細(xì)胞增生李斯特菌的選擇性增菌培養(yǎng)液，本人前期也采用SEL建立了一種多重實時熒光PCR檢測平臺[10]，但目前對該培養(yǎng)基修復(fù)并增菌培養(yǎng)損傷致病菌的能力尚不清楚。

本研究以鼠傷寒沙門氏菌為供試菌株，采用熱激的方法得到亞致死損傷細(xì)胞，進而研究其在SEL中的修復(fù)能力，建立實時熒光PCR檢測技術(shù)，并在人工污染的牛肉樣品中進行檢測試驗，從而建立一種新型的基于選擇性培養(yǎng)基SEL的損傷沙門氏菌的修復(fù)、選擇性增菌和實時熒光PCR檢測平臺。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella entericaTyphimurium ATCC14028) 美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所。

木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)、營養(yǎng)肉湯(NB)、營養(yǎng)肉湯瓊脂(NA)、營養(yǎng)肉湯瓊脂(NASA，添加4% NaCl)、緩沖李氏菌增菌肉湯(BLEB) 美國BD公司。

DNeasy組織總DNA提取試劑盒 美國Qiagen公司；抗生素Acriflavine、Nalidixic acid sodium salt、Phosphomycin disodium salt以及 Cycloheximide C 美國Sigma公司；熒光定量PCR試劑盒 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；引物和實時熒光PCR探針由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成。

恒溫混合器、移液器 德國Eppendorf公司；ABI 7500型實時熒光PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；NanoDrop ND-100分光光度計 美國NanoDrop科技公司。

1.2 方法

1.2.1 熱損傷沙門氏菌的制備

將鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028于37℃培養(yǎng)3.5h至指數(shù)后期，取0.5mL于55℃熱激處理6min后，熱激亞致死損傷細(xì)胞立即用于下步操作。

1.2.2 亞致死沙門氏菌在選擇性增菌培養(yǎng)液SEL中的修復(fù)

將熱激后的亞致死沙門氏菌菌液用0.9%生理鹽水進行梯度稀釋，分別在NA、XLD和NASA上測定活性細(xì)胞的數(shù)目。取50μL梯度稀釋后的亞致死菌液分別加入到有5mL BLEB培養(yǎng)基的20mL PA瓶中，以無菌0.9%生理鹽水作為空白對照，37℃、150r/min振蕩修復(fù)培養(yǎng)0、1h和2h后，根據(jù)選擇性增菌液SEL的配方[9]，加入各種抗生素，以得到終質(zhì)量濃度分別為0.01g/L的Acriflavine、0.05g/L的Cycloheximide、0.05g/L的Fosfomycin以及0.002g/L的Nalidixic acid。同等條件下再培養(yǎng)6h和20h后，從每個處理中各取1mL用于活細(xì)胞計數(shù)。每樣重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 亞致死損傷沙門氏菌細(xì)胞數(shù)目的測定

參照Aljarallah等的方法進行[11]，將熱激或SEL培養(yǎng)后的菌液經(jīng)10倍系列稀釋后，取0.1mL涂布于NA、XLD和NASA平板上，細(xì)胞外膜受損的亞致死細(xì)胞無法在XLD培養(yǎng)上生長，而細(xì)胞質(zhì)膜受損的亞致死細(xì)胞無法在NASA培養(yǎng)基上生長，而亞致死損傷細(xì)胞在NA培養(yǎng)基上可以正常生長[11]。涂布后的NA和XLD平板在37℃培養(yǎng)24h，NASA平板培養(yǎng)48h，預(yù)實驗也證明更長的培養(yǎng)時間對存活細(xì)胞的計數(shù)結(jié)果沒有任何影響。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)各培養(yǎng)基上的菌落形成單位(CFU)，根據(jù)各試驗結(jié)果，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4 基因組DNA的提取

1mL的細(xì)菌培養(yǎng)液用8000×g離心10min收集細(xì)胞后，用QIAGEN DNeasy Tissue Kit試劑盒法提取基因組DNA。提取后的基因組DNA用NanoDrop ND-100分光光度計確定所提取基因組DNA溶液的濃度與純度。

1.2.5 實時熒光PCR

參照前期建立的實時熒光PCR方法[10]，所用invA基因引物的特異性已經(jīng)得到證明。上游引物序列為：GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG；下游引物序列為：GGAGGCTTCCGG GTCAAG；TaqMan探針序列為：CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC，探針的3′端標(biāo)記有FAM熒光染料。每20μL實時熒光PCR反應(yīng)體系中包含1×緩沖液、200nmol/L引物和探針、以及2μL的基因組DNA。混勻后，加入96孔板中，再加入2μL待檢測的模板基因組DNA，置實時熒光PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃熱啟動10min，隨后是40個循環(huán)的95℃變性15s以及60℃復(fù)性和延伸1min。

1.2.6 亞致死沙門氏菌修復(fù)與實時熒光檢測技術(shù)在人工污染食品樣品中的應(yīng)用

將0.1mL梯度稀釋后的亞致死鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028分別人工污染于10g碎牛肉樣品中，供試碎牛肉購自附近超市，并預(yù)先用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法(《USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook》)驗證樣品中不含有沙門氏菌的污染。在SEL選擇性增菌培養(yǎng)液中增菌培養(yǎng)20h后，1mL增菌液用于基因組DNA的提取和實時熒光PCR檢測，同時，樣品中修復(fù)并增菌后沙門氏菌的數(shù)目也用XLD選擇性平板計數(shù)法測定，以作為該實時熒光PCR檢測方法的對照。人工污染試驗重復(fù)進行3次，每次包含兩個平行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱損傷沙門氏菌在選擇性培養(yǎng)基SEL中的修復(fù)

本試驗用選擇性增菌培養(yǎng)基SEL回復(fù)培養(yǎng)55℃熱激亞致死損傷的沙門氏菌，結(jié)果如表1所示，熱激后的起始各濃度沙門氏菌細(xì)胞在XLD上的活細(xì)胞數(shù)目較在NA上少，而NASA平板上均不可生長，說明部分細(xì)胞的外膜受到了損傷，而幾乎全部活性細(xì)胞的質(zhì)膜均受到了不同程度的損傷，為亞致死損傷細(xì)胞[11]。在SEL中增菌培養(yǎng)后的結(jié)果表明，如果接種量大于1.80×102CFU/5mL SEL時，在亞致死損傷細(xì)胞經(jīng)過2h的非選擇性修復(fù)培養(yǎng)后，再在加入選擇性抗生素的SEL中經(jīng)過6h的增菌培養(yǎng)，在XLD和NASA培養(yǎng)基上能檢出與在NA培養(yǎng)基上大致相等的菌落數(shù)目，如果只經(jīng)過1h的回復(fù)培養(yǎng)，則1.80×102CFU/5mL SEL接種量的PA瓶中的菌液在NASA上無活性細(xì)胞檢出。而沒有經(jīng)過回復(fù)培養(yǎng)的細(xì)菌，經(jīng)過6h的增菌培養(yǎng)后，1.80×102CFU/5mL SEL或更低接種量的菌液在3種培養(yǎng)基上均無活性細(xì)胞檢出，更高接種量的菌液經(jīng)過6h的SEL培養(yǎng)后，在3種培養(yǎng)基上的活性細(xì)胞數(shù)目基本一致，但與初始接種量相比，細(xì)胞數(shù)目并沒有得到明顯的增加。在SEL中經(jīng)過20h的增菌培養(yǎng)后，無論是否經(jīng)過一定時間的修復(fù)培養(yǎng)，各接種量菌液中的細(xì)胞都能得到完全修復(fù)并增菌到109CFU/mL。

2.2 實時熒光PCR檢測靈敏度

圖1 沙門氏菌實時熒光PCR檢測靈敏度Fig.1 Detection sensitivity of Salmonella by Real time PCR

圖2 沙門氏菌實時熒光PCR檢測效率Fig.2 Detection efficiency of Salmonella by Real time PCR

為了測定實時熒光PCR檢測沙門氏菌的擴增效率，采用鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028作為供試菌株，根據(jù)不同濃度的基因組DNA的擴增結(jié)果計算出標(biāo)出曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k(－3.4371)，由公式E＝(10－1/k)－1計算出擴增效率(E)。如圖1、2所示，各質(zhì)量濃度基因組DNA擴增曲線之間距離均勻，擴增效率為95.41%，最低為4個拷貝數(shù)的沙門氏菌基因組DNA可被檢測出。

表1 熱損傷沙門氏菌在SEL培養(yǎng)液中的修復(fù)和增菌培養(yǎng)結(jié)果Table 1 Results of recovery and enrichment of thermal injured Salmonella in SEL broth

2.3 實時熒光PCR檢測方法在人工污染碎牛肉樣品中的應(yīng)用

一系列10倍梯度稀釋的熱激亞致死鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028接種于10g碎牛肉中，經(jīng)過在SEL中20h的增菌培養(yǎng)后，增菌液用于實時熒光PCR檢測，同時用選擇性XLD平板對各致病菌進行計數(shù)作為對照。結(jié)果如表2所示，經(jīng)過20h的增菌培養(yǎng)后，用這兩種檢測方法均能從10g碎牛肉樣品中檢測出最低起始數(shù)目為3CFU的沙門氏菌，然而， 實時熒光PCR定量檢測結(jié)果得到的細(xì)胞數(shù)目略高于平板菌落計數(shù)結(jié)果。

表2 實時熒光PCR結(jié)合SEL選擇性增菌法從人工污染碎牛肉樣品中檢測沙門氏菌Table 2 Real-time PCR combined with SEL broth for detection of Salmonella in spiked ground beef

3 討 論

細(xì)菌受到熱激處理后會出現(xiàn)亞致死損傷甚至死亡，亞致死致病菌的檢測也是食品安全研究檢測的熱點和難點之一[5]。食品中亞致死損傷細(xì)胞的存在為食源性致病菌安全檢測提出了新的要求，必須引起人們的足夠重視，因為在食源性致病菌檢測過程中，亞致死損傷細(xì)胞的存在有可能會高估致病菌的數(shù)目[12]，也有可能會造成假陰性檢測結(jié)果，特別是當(dāng)用選擇性培養(yǎng)基檢測致病菌的時候[13]，在后面一種情況下，必須包括一個亞致死損傷細(xì)胞的修復(fù)培養(yǎng)步驟。

目前用于亞致死損傷致病菌修復(fù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基大多采用不含選擇性成分的營養(yǎng)培養(yǎng)基，如BPW、UPB以及TSB等[5,14]。曾慶梅等[15]研究了不同介質(zhì)、溫度和時間對熱損傷腸炎沙門氏菌的修復(fù)的影響，得出最佳修復(fù)條件為營養(yǎng)肉湯37℃修復(fù)2h。然而，這些培養(yǎng)基均無法滿足檢測目標(biāo)致病菌選擇性增菌的需要。由于食品樣品中大量背景菌群的存在，選擇性增菌培養(yǎng)也是避免出現(xiàn)假性檢測結(jié)果的重要步驟[16]。本實驗首次評價了選擇性增菌培養(yǎng)液SEL修復(fù)以及增菌培養(yǎng)熱致亞致死損傷鼠傷寒沙門氏菌的能力，結(jié)果表明了該培養(yǎng)液除了能夠選擇性增菌培養(yǎng)沙門氏菌之外[9]，也能夠很好的修復(fù)鼠傷寒沙門氏菌外膜和質(zhì)膜的損傷關(guān)鍵部位，但與前人報道的非選擇性培養(yǎng)液相比[17]，添加了抗生素的該選擇性培養(yǎng)基也明顯延緩了細(xì)胞生長速度，既使經(jīng)過1～2h的修復(fù)培養(yǎng)，6h的增菌培養(yǎng)也無法將1.80×101CFU/5mL SEL或更低的細(xì)胞增菌至可檢出水平，因此，20h的增菌培養(yǎng)對于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測，仍是亞致死損傷沙門氏菌修復(fù)和增菌至可檢出水平所必須的。在該增菌培養(yǎng)條件下，即使不經(jīng)過非選擇性修復(fù)步驟，1～2CFU/5mL SEL的熱激亞致死沙門氏菌也能夠增菌至可檢出水平。

在人工污染的碎牛肉樣品中，結(jié)合SEL選擇性增菌培養(yǎng)液，經(jīng)過20h的培養(yǎng)，本實時熒光PCR檢測方法能在大量背景菌存在的條件下，從10g碎牛肉樣品中修復(fù)、增菌并檢測出2～3CFU的沙門氏菌，這也是目前實時熒光PCR等分子生物學(xué)方法所能達到的最低檢測限[16]。

本研究采用了活性平板計數(shù)的方法對增菌后的人工污染碎牛肉樣品中的致病菌進行了計數(shù)，并與實時熒光PCR的定量結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明在所得到的分別用CFU/mL與基因組DNA拷貝/mL表示的定量結(jié)果之間有一定的差異，這是因為活細(xì)胞技術(shù)的方法僅僅可以測定能在選擇性平板上生長的具有活性的細(xì)胞，而PCR的方法定量的結(jié)果則包括了所有可培養(yǎng)以及不可培養(yǎng)的細(xì)胞，因而在食品樣品中檢測出的基因拷貝數(shù)結(jié)果大多高于活細(xì)胞數(shù)目。

至于該實時熒光PCR的檢測速率，從樣品增菌到檢測結(jié)果的分析，整個檢測過程可在24h內(nèi)完成。與傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的方法所需要的5～7d才能得到結(jié)果相比，本研究所開發(fā)的實時熒光PCR方法顯著提高了食品中沙門氏菌檢測的效率。

總之，本研究基于選擇性增菌培養(yǎng)液SEL，開發(fā)出了一個快速、靈敏的實時熒光PCR方法以從食品樣品中選擇性修復(fù)、增菌并檢測出熱損傷沙門氏菌。經(jīng)過對其檢測靈敏度和有效性的綜合評價，本檢測方法可以完成大量食品樣品中包括亞致死細(xì)胞在內(nèi)的沙門氏菌高效快速檢測。

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Selective Enrichment and Real time PCR Detection of Thermal Injured Salmonella in Food

SUO Biao1,2，TENG Yao-hui1，SHI Xian-ming2，AI Zhi-lu1
(1. College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；
2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

A selective enrichment broth, SEL based real time PCR assay was established after treating a sublethal injuredSalmonellacells by heat-shock. The results showed that 1－2 CFU of injuredSalmonellacells in 5 mL SEL could be fully recovered and enriched to the level of 109CFU/mL after a 20 h enrichment step even without the nonselective recovery process. The amplification efficiency of real time PCR was 95.41% and the detection limit was 4 CFU/reaction forSalmonellagenomic DNA.The detection limit in artificially contaminated food sample was 3 CFU/10 g ground beef, and showed a high coincidence to the detection result by traditional culture-based assay. The overall recovery, selective enrichment and detection procedure of thermal injuredSalmonella could be accomplished in 24 h, which showed a high potential of application in the effective detection ofSalmonellain food.

thermal injury；Salmonella；selective enrichment；real time polymerase chain reaction (PCR)；detection

TS254.1

A

1002-6630(2012)10-0223-05

2011-04-17

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)(人才引進/博士啟動)基金項目(30300168)；河南省重點科技攻關(guān)計劃項目(082102320006)

索標(biāo)(1982—)，男，副教授，博士，研究方向為食品微生物分子生態(tài)與食品安全。E-mail：suobiao@gmail.com