鄭二麗，楊曉泉，吳娜娜

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食物蛋白工程研究所，廣東廣州 510640)

不同的二價陽離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+）對大豆蛋白分級效果的影響

鄭二麗，楊曉泉*，吳娜娜

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食物蛋白工程研究所，廣東廣州 510640)

向脫脂豆?jié){中加入不同的二價陽離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+），考察它們在大豆蛋白分級過程中對去除親脂性蛋白的效果。結(jié)果顯示，三種離子的加入均降低了樣品的蛋白提取率，同時總脂含量也有所減少，根據(jù)SDS-PAGE分析，在一定的濃度范圍內(nèi)，所減少的蛋白組分可能是與脂緊密結(jié)合的組分（僅限CaCl2及MgCl2的添加）；同濃度的CaCl2處理所得樣品總脂含量減少最多，且其蛋白提取率稍低于MgCl2處理所得樣品，但高于ZnCl2處理所得樣品，結(jié)合TLC分析，表明Ca2+去除親脂性蛋白的作用效果最好，以此作為沉淀劑的最佳分級條件為：在pH7.0下添加10mmol/L的CaCl2，所得樣品蛋白提取率降低了33%，但蛋白含量由88.45%增加到92.58%（干基），同時總脂含量由4.83%降低到2.01%。

二價陽離子，大豆蛋白，親脂性蛋白，總脂含量

大豆種子蛋白包含清蛋白與球蛋白，而球蛋白是主要的儲存蛋白，根據(jù)電泳圖譜分析，儲存蛋白主要由7S球蛋白與11S球蛋白組成，它們不僅價格低廉、營養(yǎng)豐富，并且還具有較高的功能特性，如7S蛋白具有較好的水溶解性、乳化能力和乳化穩(wěn)定性，而11S蛋白具有更好的凝膠硬度、凝膠拉伸強(qiáng)度及凝膠保水性，這些特性提高了大豆蛋白在食品加工中的作用，同時也增大了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。近幾年也有學(xué)者提出大豆儲存蛋白中不僅含有7S、11S，還含有一種結(jié)合有磷脂的親脂性蛋白（LP）[1]。這種親脂性蛋白是一種膜蛋白，一般來說膜蛋白是一種高度疏水及親油的蛋白，這無疑會影響蛋白質(zhì)的溶解性，同時還會影響蛋白的乳化性及起泡性[2]。LP是大豆蛋白中與磷脂、糖脂等極性脂相結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱，有學(xué)者報道蛋白中產(chǎn)生這種不良的風(fēng)味主要是因為在脫脂豆粉中還存在一些極性脂[3-4]。磷脂自動氧化生成的一些小分子物質(zhì)正是影響大豆風(fēng)味的揮發(fā)性成分，這表明LP的存在還會影響蛋白的風(fēng)味及色澤。因此，從大豆蛋白中除去LP即能提高蛋白的功能特性，還可改善蛋白風(fēng)味，提高其利用率。1998年Samoto等[5]在酸性條件下（pH2.8）向脫脂大豆?jié){中各加入30mmol/L的Na2SO4和CaCl2，超速離心（10000×g，10min），可有效地提取出油體結(jié)合蛋白較多的SPI及油體結(jié)合蛋白較少的SPI，這種分級的方法需要較高的離心力，限制了工業(yè)化的生產(chǎn)。2007年Samoto等通過三步法從豆粕中分離出LP組分，進(jìn)而改善了大豆分離蛋白風(fēng)味[1]。當(dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，鈣在水相體系中能與大豆蛋白結(jié)合而導(dǎo)致后者發(fā)生聚集。而鈣、鎂、鋅同屬于堿土金屬，因此可以推測，鎂鹽與鋅鹽也可作為大豆蛋白的沉淀劑[6]。Yuan等[7]人認(rèn)為可能由于7S與11S的表面電荷密度不同，沉淀這兩種組分所需的陽離子的量不同，因此可以通過調(diào)節(jié)pH及離子的添加量分離這兩種組分。LP作為新提出的蛋白組分，電荷密度與其他兩種組分也會不同，因此可以通過二價陽離子的沉淀作用，分離出LP組分，以改善大豆蛋白的風(fēng)味及功能性質(zhì)。本實驗主要是通過分析二價陽離子處理所得樣品在蛋白提取率、蛋白含量、總脂含量及SDS-PAGE電泳圖譜的不同，來比較鈣、鎂、鋅三種離子對分離LP組分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕 山東禹王有限公司，蛋白質(zhì)含量53.8%（w/w，干基），含水量8.8%，脂含量5.6%（w/w，干基），氮溶指數(shù)85.4%，將其于4℃保存以備用。

DYF-500搖擺式高壓萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇宏華儀器廠；DELTAT-24/LSC冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司；ECP3000三恒電泳儀 北京市六一儀器廠；RapidNCube快速定氮儀 德國Elementrar公司；SevenEasypH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；P-1薄層層析展開缸 上海信誼儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 普通酸沉蛋白的提取 低溫脫脂豆粕粉碎后，過60目篩，取40g以上處理所得的豆粉添加400mL水，用2mol/L的NaOH調(diào)pH8.0，提取液于常溫下攪拌2h，然后15℃、4000×g下離心10min，乳液用2mol/L的HCl將pH調(diào)至4.5，攪拌30min后，15℃、2000×g下離心10min，沉淀即為酸沉大豆蛋白（APP），用去離子水重新分散并調(diào)節(jié)pH至7.5，經(jīng)過透析后進(jìn)行冷凍干燥，置于4℃密封保存?zhèn)溆?，以此方法提取的分離蛋白為對照蛋白。

1.2.2 改進(jìn)的提取分離蛋白方法 豆粉以1∶10的比例加水后，用2mol/L的NaOH調(diào)pH7.0～8.0，攪拌1h后分別加入0～30mmol/L的MgCl2、CaCl2、ZnCl2，于50℃下水浴1h，取出迅速冷卻，回調(diào)pH至起始值，以下步驟同上1.2.1，所得蛋白不同鹽離子處理所得分離蛋白。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量和提取率的測定 取適量樣品于130℃下干燥3h[8]，測定水分含量。采用Jung S方法測定各蛋白組分的含氮量[9]，蛋白質(zhì)含量=含氮量×6.25。

根據(jù)所得各蛋白組分的蛋白質(zhì)含量、脫脂豆粉的質(zhì)量和總蛋白質(zhì)含量，可得各組分的蛋白質(zhì)提取率，即蛋白質(zhì)提取率=[所得樣品的質(zhì)量×（1-水分含量）×其蛋白含量]/[原脫脂豆粉質(zhì)量×（1-水分含量）×豆粉中蛋白含量]×100%。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 根據(jù)

Laemmli的方法[10]進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠和分離膠濃度分別為12.5%和3%（w/V），考馬斯亮藍(lán)（CBB）R250染色。參照Mujoo等[11]的方法辨別11S、7S及LP各亞基，11S、7S及LP組分的純度為各自亞基的密度之和與它們?nèi)齻€總密度的比值。

1.2.5 總脂的測定 參考國標(biāo)GB2906-1982[12]采用索氏抽提法測定各組分的極性脂含量，以氯仿∶甲醇（體積比1∶2）為抽提劑。其中：極性脂含量（干基）=極性脂類質(zhì)量/[試樣質(zhì)量×（1-水分含量）]×100%

1.2.6 TLC分析 薄層層析方法具體操作如下：取1.0g凍干的樣品加入10mL氯仿/甲醇（1∶2，V/V）的混合液，在50℃下萃取1h，將萃取液烘干，再加入1mL氯仿/甲醇（1∶2，V/V）的混合液，然后取10μL點(diǎn)到硅膠H薄層板上，用氯仿/甲醇/冰醋酸/水（85∶15∶10∶3，V/V）混合液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%的硫酸溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[2]。

1.2.7 統(tǒng)計分析 所有實驗重復(fù)三次。通過方差分析（ANOVA）和線性回歸模式（GLM）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以5%最小置信度（LSD）進(jìn)行數(shù)據(jù)計算，并使用SAS系統(tǒng)進(jìn)行均值比較（Version 13，SAS Institute Inc.，Cary，N.C.，U.S.A.）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)提取率及蛋白含量的分析

添加不同的二價陽離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+）對所得樣品的蛋白提取率及蛋白含量的影響如表1所示。由表可知，由二價陽離子處理所得樣品的提取率都有所降低（對比APP），其中以鋅離子處理的樣品下降幅度最大，其次是鈣離子。此現(xiàn)象與A.G.Appu Rao等[13]的研究結(jié)果類似，他們用三種離子沉淀7S，鈣離子可以沉淀40%，鎂離子沉淀10%，而鋅離子則沉淀90%的7S，這表明鋅離子與蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng)。此外，蛋白的提取率隨著陽離子的增加而逐漸降低，尤其是鋅離子，在添加5mmol/L時提取率就降低了1/3（相對APP），并且在pH7.0時提取率受陽離子濃度的影響最大，這主要是因為pH影響著陽離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合?？偟膩碚f，蛋白提取率的降低是由于部分蛋白與陽離子結(jié)合沉淀到豆渣中去，被沉淀的蛋白組分還需進(jìn)一步分析。

蛋白含量的變化也存在較大的差異，從表中可看出，在低離子濃度時（≤5mmol/L）蛋白含量都有所增加（與APP相比），隨后蛋白含量隨著ZnCl2的增加而有所降低，但隨著CaCl2、MgCl2的增加反而增加，這進(jìn)一步說明了鋅與蛋白的結(jié)合能力要高于其他兩種離子，較少量的鋅鹽就可以沉淀較多的蛋白到豆渣中去，使樣品中蛋白含量降低，而鈣、鎂與蛋白的結(jié)合性遠(yuǎn)低于鋅，在沉淀部分蛋白的同時更沉淀了較多的其他小分子物質(zhì)，從而提高了樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2.2 總脂含量的分析

表2為二價陽離子對樣品中總脂含量變化的影響，表中顯示，僅熱處理（0mmol/L）就降低了蛋白中總脂的含量（對比0mmol/L與APP）；隨著鹽的增加，總脂含量在逐漸降低，但添加Ca2+對脂含量影響最大，其次是Mg2+，結(jié)合蛋白提取率及蛋白含量的變化，可說明這兩種離子沉淀的蛋白可能是與脂緊密結(jié)合的組分，即為Samoto等[2]提出的親脂性蛋白（LP），這種蛋白與磷脂等極性脂緊密結(jié)合。Zn2+的添加對樣品中總脂含量的影響不是很大，但表1中的蛋白提取率降低幅度最大，這表明Zn2+沒有選擇性地沉淀LP組分，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于Zn2+的離子半徑及配位構(gòu)型與其他兩種離子的不同[14-16]，導(dǎo)致與蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度不同。

表1 不同的pH下添加不同的二價陽離子對所得樣品蛋白提取率及蛋白含量的影響Table 1 Effect of different pH and divalent cations on protein recovery rate and protein content

表2 不同的pH條件下添加不同的二價陽離子對樣品中總脂含量的影響Table2 EffectofdifferentpH anddivalentcationsonlipidcontent

2.3 SDS-PAGE電泳分析

圖1 不同的pH及添加不同陽離子分級所得的分離蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of the protein samples obtained with different pH and divalent cations

添加不同二價陽離子處理后所得分離蛋白樣品電泳圖譜存在較大的差異，圖A為在不同的pH條件下添加不同濃度的CaCl2所得分離蛋白的電泳圖，對比APP中P34條帶，添加CaCl2后它的含量有所減少，有文獻(xiàn)表述P34是與極性脂緊密結(jié)合的蛋白組分[17]，通常也被稱為脂結(jié)合蛋白。添加CaCl2的量不同，對所得分離蛋白各亞基組成的影響程度不同，在低濃度時（pH7.0時≤10mmol/L，pH7.5時≤15mmol/L及pH8.0時≤20mmol/L），除了P34條帶的含量較少外，7S與11S各亞基沒有很大的變化，這說明此濃度范圍內(nèi)蛋白提取率的降低可能是脂結(jié)合蛋白；超過一定的濃度范圍后，7S各亞基的含量會逐漸增加，而11S各亞基含量在減少，這說明開始有11S組分沉淀到豆渣中，這與Yuan等[7]的研究結(jié)果類似，Yuan等提出沉淀1mol的7S比沉淀1mol的11S所需要鈣離子的量大得多，原因可能是因為7S分子量比11S小，且表面電荷密度比11S的多。綜上可得，Ca2+所沉淀三種組分的順序為：親脂性蛋白＞11S＞7S，具體原理還需進(jìn)一步探討。

B圖為添加ZnCl2所得分離蛋白的電泳圖譜，由圖可看出，各條帶之間蛋白組分的亞基沒有差異，這進(jìn)一步表明Zn2+與蛋白的結(jié)合與其它兩種離子不同，可能是Zn2+與蛋白的結(jié)合性太強(qiáng)，很少量的Zn2+即可沉淀各蛋白組分。

2.4 TLC分析

本實驗中薄層層析以氯仿∶甲醇（1∶2，V/V）為萃取溶劑萃取極性脂，以氯仿/甲醇/冰醋酸/水（85∶15∶10∶3，V/V）混合液為展開劑，分析樣品中極性脂的變化。圖2（左）中CaCl2的添加明顯地減少了極性脂的含量，尤其是帶2（pH7.0、10mmol/L CaCl2），且隨著pH的增加樣品中色譜條帶逐漸清晰，這說明極性脂的量在增加，與2.2中總脂含量變化趨勢一致。結(jié)合蛋白提取率及總脂含量的分析，可得出結(jié)論，在低CaCl2濃度下，沉淀的組分可能是與極性脂相結(jié)合的蛋白組分，且pH嚴(yán)重影響著Ca2+與蛋白的結(jié)合；圖2（右）為經(jīng)過MgCl2處理所得分離蛋白的色譜圖，圖中表明極性脂的含量是有所減少（相比APP），但1′～3′帶沒很大的變化，這說明pH對Mg2+與蛋白的結(jié)合性影響沒有Ca2+與蛋白的結(jié)合性大，隨著Mg2+的增加色譜變化沒有Ca2+的顯著（文中未顯示），可能是Mg2+與蛋白的結(jié)合性弱所致；Zn2+處理所得分離蛋白的色譜圖（未列出）與電泳圖譜類似，所有條帶均無變化，可能是Zn2+在沉淀脂結(jié)合蛋白的同時也沉淀了7S與11S組分，使所得分離蛋白中極性脂的含量不受鋅離子的影響。

圖2 不同方法處理所得的大豆蛋白的TLC圖譜Fig.2 TLC of lipids from protein fractions with different treatment

3 結(jié)論

CaCl2、MgCl2、ZnCl2的添加均降低了蛋白得率（與APP相比），同時也降低了總脂含量，結(jié)果表明，經(jīng)過二價陽離子處理使脂類沉淀到豆渣中去，這樣可以改善分離蛋白的一些功能特性。但由于它們與蛋白的結(jié)合強(qiáng)度不同，導(dǎo)致所降低的程度不同，將蛋白得率與總脂含量結(jié)合考慮，可得添加Ca2+去除親脂性蛋白的作用效果最好，Mg2+次之，Zn2+的作用效果最小。

通過SDS-PAGE顯示，在一定的濃度范圍內(nèi)，添加CaCl2、MgCl2可以沉淀出親脂性蛋白，此后開始有11S被沉淀下來，最后是7S，但ZnCl2的沉淀親脂性蛋白的效果不是很明顯。

以CaCl2作為沉淀劑去除親脂性蛋白，結(jié)合pH的影響，較優(yōu)的分離條件為：pH7.0、50℃加熱1h的同時加入10mmol/L的CaCl2。用此條件所得樣品的蛋白提取率為APP的2/3，且總脂含量降低了45%。

[1]Samoto M，Maebuchi M，et al.Abundant proteins associated with lecithin in soy protein isolate[J].Agric Food Chem，2007，102：317-322.

[2]Damodaran S.Protein stabilization of emulsions and foams[J]. Food Sci，2005，70：R54-R66.

[3]Anderson RL.Acid-sensitive soy proteins affect flavor[J]. Journal of Food Science，1976，41：293.

[4]Kalinski A，Weisemann JM，Matthew BF，et al.Molecular cloning of a protein associated with soybean oil bodies that is similar to thiol proteinases of the papain family[J].The Journal of Biological Chemistry，1990，265：13843-13848.

[5]Samoto M，Miyazaki C，Kanamori J，et al.Improvement of the off-flavor of soy protein isolate by removing oil-body associated proteins and polar lipids[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry，1998，62（5）：935-940.

[6]Molina MI，Wagner JR.The effects of divalent cations in the presence of phosphate，citrate and chloride on the aggregation of soy protein isolate[J].Food Res Int，1999，32：135-143.

[7]Yong J，Yuan，Orlin D，et al.Effect of pH and Ca2+induced associations of soybean proteins[J].Agric Food Chem，2002，50：4953-4958.

[8]AOAC.Offcial methods of analysis of the association of official analytical chemists[S].16th edn.AOAC，Arlington Method，1995，925：10.

[9]Jung S，Rickert DA，Deak NA，et al.Comparison of Kjeldahl and Dumas methods for determining protein contents of soybean products[J].Am Oil Chem Soc，2003，80：1169-1173.

[10]Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227：6850-6851.

[11]Mujoo R，Trinh DT，Ng PKW.Characterization of storage proteins in different soybean varieties and their relationship to tofu yield and texture[J].Food Chemistry，2003，82：265-273.

[12]GB2906-1982.谷物、油料作物種子粗脂肪測定方法[S].

[13]Appu Rao AG，Narasinga Rao.Binding of calcium（Ⅱ），magnesium（Ⅱ），and zinc（Ⅱ）by 7S fraction of soybean proteins [J].Agric Food Chem，1976，24（3）：490-494.

[14]Bock CW，Katz AK，Glusker J P.Hydration of zinc ions：a comparison with magnesium and beryllium ions[J].Am Chem Soc，1995，117：3754-3765.

[15]Bock CW，Katz AK，Markham GD，et al.Manganese as a replacement for magnesium and zinc：functional comparison of the divalent ions[J].Am Chem Soc，1999，121：7360-7372.

[16]Gulsker JP，Katz AK，Bock CW.Metal ions in biological systems[J].Rigaku，1999，16：8-16.

[17]Kalinski A，Melroy DL，Dwivedi RS，et al.A soybean vacuolar protein（P34）related to thiol proteases is synthesized as a glycoprotein precursor during seed maturation[J].Biol Chem，1992，267：12068-12076.

Effect of different divalent cations（Ca2+，Mg2+，Zn2+）on fractionation of soy protein

ZHENG Er-li，YANG Xiao-quan*，WU Na-na
（Research and Development Center of Food Proteins，College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Effect of different divalent cations on the removal lipophilic protein from the soy protein was compared. The results indicated that the protein recovery rates and the lipid contents were decreased using divalent cations in the fractionation process.The removed protein might be the protein fraction associated with lipids at a certain concentration of CaCl2or MgCl2.Lipid content of the sample prepared with CaCl2was reduced mostly，and the protein recovery rate was a little smaller than MgCl2treatment，but significantly higher than ZnCl2treatment.So Ca2+was the best precipitation agent which can remove lipophilic protein from the soy protein effectively.The optimized fractionation condition was pH7.0 in the presence of 10mmol/L CaCl2，and the protein recovery rate was decreased by 33%，whereas the protein content increased from 88.45%to 92.58%，and simultaneously the lipid content decreased from 4.83%to 2.01%.

divalent cations；soy protein；lipophilic protein；lipid content

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）05-0108-05

2011－04－25 *通訊聯(lián)系人

鄭二麗（1986-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

嶺南大學(xué)糧油項目（20100529）。