李東華，楊 博

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

響應(yīng)面法優(yōu)化膠質(zhì)芽孢桿菌GM 1增殖發(fā)酵培養(yǎng)基

李東華，楊 博*

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

在搖瓶培養(yǎng)條件下，優(yōu)化提高膠質(zhì)芽孢桿菌GM1菌體濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基組分。在單因素的基礎(chǔ)上選擇糖蜜、復(fù)合氮源（硫酸氨與豆粕）以及初始pH為自變量，芽孢桿菌數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以及Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸分析，確定了膠質(zhì)芽孢桿菌GM1發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為：糖蜜3.2%、復(fù)合氮源0.4%，pH為8.0，在此條件下最大理論數(shù)值為3.03×108CFU·mL-1。經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際活菌體數(shù)為3.09×108CFU·mL-1，該實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合較好。優(yōu)化后的活菌濃度與優(yōu)化前菌體濃度相比提高了40%，由此可知，響應(yīng)面分析法優(yōu)化微生物發(fā)酵條件是一種十分有效的方法。

膠質(zhì)芽孢桿菌，響應(yīng)面法，菌體密度，優(yōu)化

膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）是一種能分解硅酸鹽礦物的細(xì)菌，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者也把它稱為硅酸鹽細(xì)菌[1]。除此之外膠質(zhì)芽孢桿菌還具有解磷、解鉀、固氮的作用，它不僅可以提高土壤中可溶性磷和鉀的含量，而且還有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病性，以及改善土壤結(jié)構(gòu)等作用，是良好的微生態(tài)肥料生產(chǎn)菌種[2-3]，所以最近幾年來對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌在生物肥料領(lǐng)域中的應(yīng)用研究越來越多。中國(guó)鉀肥資源嚴(yán)重不足[4]，國(guó)家每年需大量進(jìn)口無機(jī)鉀肥。開發(fā)利用微生態(tài)鉀、磷肥不僅可以帶來較好的經(jīng)濟(jì)效益，也能維護(hù)生態(tài)平衡。因此，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)來說，如何降低投入成本、采用價(jià)格低廉且來源豐富的原材料作為膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)基具有重要的意義。本研究以前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法[5-6]對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，這對(duì)有效地利用和促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可為生物菌肥的研制提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）GM1 由華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院篩選保存；斜面培養(yǎng)基 膠凍樣芽孢桿菌瓊脂培養(yǎng)基[7]；種子液 蔗糖5g/L、NaHPO42g/L、MgSO40.5g/L、CaCO30.1g/L、FeCl35mg/L、pH 7.5～8.5，蒸餾水體積1000m L；單因素實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基 糖蜜1%～5%、復(fù)合氮源（硫酸氨∶豆粕=2∶1）0.2%～0.5%、K2HPO42g/L、MgSO41g/L、CaCO31g/L、FeCl35mg/L、pH7.5，蒸餾水體積1000m L。

PHS-3C型手持式pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；CP2245型電子天平感量0.0001g 德國(guó)Sartorius公司；DSHZ－300A型全溫生化培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；HJ-VD-650型超凈工作臺(tái)（SW-CJ） 上海凈化；YXQ-SG46-280S型壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅；Labnet P3960型系列移液槍 美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 斜面菌種34℃活化24h后接種一環(huán)至種子培養(yǎng)液（裝液量50m L/250m L錐形瓶），34℃培養(yǎng)42h后以5%的接種量接入單因子實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（50m L/250m L錐形瓶），34℃、200r/min培養(yǎng)42h。

1.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定 活菌數(shù)的測(cè)定采用平板稀釋法。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) a.糖蜜濃度對(duì)活菌數(shù)的影響。目前研究[10]表明，糖蜜等復(fù)合碳源比其他碳源更有利于菌體的增殖。分別選擇糖蜜濃度為1%、2%、3%、4%、5%，其他成分不變，搖瓶培養(yǎng)42h，觀察活菌數(shù)的變化，以確定最佳糖蜜濃度。b.復(fù)合氮源（硫酸氨∶豆粕=2∶1）濃度對(duì)活菌數(shù)的影響。復(fù)合氮源更有利于菌體的增殖，且復(fù)合氮源中有機(jī)和無機(jī)氮源的添加比例是一個(gè)重要的影響因素[11]。分別選擇氮源濃度為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，其他成分不變，搖瓶培養(yǎng)42h，觀察活菌數(shù)的變化以確定最佳氮源濃度。c.氮源比例（硫酸氨∶豆粕）對(duì)活菌數(shù)的影響。分別選擇氮源比例[8]為1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1，氮源濃度為0.4%，其他成分不變，搖瓶培養(yǎng)42h，觀察活菌數(shù)的變化以確定最佳氮源比例。d.初始pH對(duì)活菌數(shù)的影響。pH通過影響細(xì)胞膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及酶促反應(yīng)的穩(wěn)定性等，從而影響微生物的生長(zhǎng)速率[9]。分別調(diào)培養(yǎng)基初始pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，搖瓶培養(yǎng)42h，觀察活菌數(shù)的變化以確定最佳pH。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取對(duì)活菌數(shù)有較大影響的3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素水平編碼見表1，并且利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，以確定各因素對(duì)活菌數(shù)影響的顯著性和發(fā)酵條件的最優(yōu)組合。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳糖蜜濃度的確定 由圖1可知，當(dāng)糖蜜濃度較低時(shí)，GM1活菌數(shù)隨著糖蜜濃度的增大而增大，當(dāng)糖蜜濃度為3%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，之后隨著糖蜜濃度的增大，活菌數(shù)略有下降。因此確定糖蜜最佳濃度為3%。且從作者以前做過的實(shí)驗(yàn)中可知，糖蜜濃度越高，發(fā)酵后pH越低，很有可能抑制GM 1的生長(zhǎng)。

圖1 糖蜜濃度對(duì)菌體密度的影響Fig.1 Influence of themolasses on the spore production ofGM1

2.1.2 最佳復(fù)合氮源濃度的確定 由圖2可知，隨著復(fù)合氮源濃度的增加，GM 1活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合氮源濃度為0.4%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，之后隨著復(fù)合氮源濃度的增大，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。因此，確定復(fù)合氮源最佳濃度為0.4%。無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更易被菌體直接吸收利用，促進(jìn)菌體增殖，這可能是因?yàn)殇@鹽中的氮與細(xì)胞中的氮處于相同的氧化水平[9]，而添加豆粕粉會(huì)在生長(zhǎng)后期作為遲效氮源對(duì)菌體增殖產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用[10]。

圖2 復(fù)合氮源濃度對(duì)菌體密度的影響Fig.2 Influence of the complex nitride on the spore production of GM1

2.1.3 最佳氮源比例的確定 由圖3可知，隨著無機(jī)氮與有機(jī)氮比例的增加，菌體密度逐漸增加，當(dāng)比例為2∶1時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值，說明此氮源比例的培養(yǎng)基最適宜微生物生長(zhǎng)繁殖，這可能是因?yàn)榫w生長(zhǎng)初期，其酶系還未建立完全，無機(jī)氮源更有利于菌體吸收利用；而當(dāng)菌體酶系建立完善后，則分解并利用營(yíng)養(yǎng)更為豐富的有機(jī)氮源[11]。

圖3 氮源比例對(duì)菌體密度的影響Fig.3 Influence of complex nitride ratio on the spore production of GM1

2.1.4 最佳pH的確定 微生物生長(zhǎng)過程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個(gè)最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長(zhǎng)速率最大。pH通過影響細(xì)胞膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長(zhǎng)速率[9]。由圖4可知，起始pH對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有明顯影響，隨著pH的增加，GM 1活菌數(shù)也呈先升高后降低的趨勢(shì)，在pH8.0時(shí)菌數(shù)達(dá)到最大值，故確定8.0作為最佳pH。實(shí)驗(yàn)表明偏堿性的條件更有利于膠質(zhì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖。

圖4 初始pH對(duì)菌體密度的影響Fig.4 Influence of pH value o on the spore production of GM1

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取糖蜜、復(fù)合氮源和初始pH三因素進(jìn)行響應(yīng)面法Box-Behnken模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型為：Y=3.00+0.0862X1+ 0.094X2-0.15X3+0.19X1X2+7.500E-003X1X3-0.038X2X3-0.21X12-0.97X22-0.39X32對(duì)所得模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3知，二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（pmodel＜0.0001），說明二次回歸模型是顯著的，失擬項(xiàng)p=0.3190＞0.05，沒有顯著意義，不必引入更高次項(xiàng)，模型適當(dāng)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9883，表明發(fā)酵GM 1活菌數(shù)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，可以應(yīng)用于膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵的理論預(yù)測(cè)。

初始pH的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)，糖蜜濃度和復(fù)合氮源濃度的二次項(xiàng)對(duì)GM 1活菌數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。各因素對(duì)活菌數(shù)量的影響順序?yàn)椋篨22＞X32＞X12＞X3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

2.3 各因素之間的交互作用

根據(jù)回歸方程在考察的區(qū)域內(nèi)利用Design Expert 8.0軟件對(duì)以上3個(gè)因素繪制響應(yīng)面圖及等高線圖（圖5～圖7），各圖表示糖蜜濃度、復(fù)合氮源濃度、pH 3個(gè)因素中一個(gè)因素取零點(diǎn)時(shí)其余2個(gè)因素對(duì)芽孢數(shù)量的影響。

圖5 糖蜜和復(fù)合氮源對(duì)GM1菌體密度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface ofmolasses and complex nitride on the spore production of GM1

圖6 復(fù)合氮源和初始對(duì)GM1菌體密度影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of complex nitride and pH on the spore production of GM1

圖7 糖蜜和初始pH對(duì)GM1菌體密度影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of themolasses and pH on the spore production of GM1

由圖5～圖7可知，3個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值（活菌數(shù)）存在極高值。3個(gè)響應(yīng)曲面的等高線中心均位于-1～1之間，說明設(shè)計(jì)的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。由圖5～圖7及軟件分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)（0.24，0.08，-0.19），即當(dāng)糖蜜濃度3.24%、復(fù)合氮源0.41%，pH為7.91時(shí)，該模型預(yù)測(cè)的GM 1活菌數(shù)為3.03×108CFU·m L-1，考慮到實(shí)際應(yīng)用，選取條件為糖蜜3.2%、復(fù)合氮源0.4%，pH為8.0，在該條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)平均活菌數(shù)為3.09×108CFU·m L-1，與理論值相差2.01%。進(jìn)一步說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。活菌體數(shù)比優(yōu)化前（2.21×108CFU·m L-1）提高了40%，由此可知響應(yīng)面分析法優(yōu)化微生物發(fā)酵條件是一種十分有效的方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要從發(fā)酵培養(yǎng)基原料易得，且成本低廉出發(fā)，用響應(yīng)面法優(yōu)化提高膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵密度，適合用于大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)生物肥料。通過對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程求解得知，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：糖蜜3.24%、復(fù)合氮源0.41%，pH為7.91，在此條件下最大理論數(shù)值為3.03×108CFU·m L-1。經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該模型是合理可靠的。優(yōu)化后的GM 1活菌濃度與優(yōu)化前菌體濃度相比提高了40%，進(jìn)一步說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到操作的方便性，可將培養(yǎng)基配方改為：糖蜜3.2%，復(fù)合氮源0.4%，pH為8.0。本實(shí)驗(yàn)對(duì)微生態(tài)制劑的研制具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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App lication of response surface methodology to optim ize the spore production of B.mucilaginosus GM 1

LIDong-hua，YANG Bo*
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

Using shaking-flask fermentation in the laboratory to op tim ize the com ponents of GM 1 fermentation medium.On the basis of sing le experiments and accord ing to the Box-Behnken experimental design p rincip les，the response surface methodology was app lied to op tim ize the three major fac tors for GM1 liquidstate fermentation.By solving the quad ratic reg ressionmodelequation，the op timal values of the variab les were determ ined as：the molasses 3.24%，com p lex nitride 0.41%，pH7.91.Then the largest number of bacteria p redic ted by the theoretical model was 3.0293×108CFU·m L-1.With the op timum medium，the live bacteria number was 3.09×108CFU·m L-1，which increased nearly more than 40%contrasting on the initial culture medium.On the conc lusion that response surface methodology was an availab le way to op tim ize the fermentation conditions.

Bacillus mucilaginosus；response surface method；colony-form ing units；op tim ization

TS201.3

B

1002-0306（2012）22-0206-04

2012－06－12 *通訊聯(lián)系人

李東華（1986-），男，碩士，主要從事發(fā)酵工程、微生態(tài)制劑方面的研究。