魏強華，冼翠芝，張薇珠，楊淑娟，潘麗華

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州 510300）

西洋菜中葉綠素提取工藝研究

魏強華，冼翠芝，張薇珠，楊淑娟，潘麗華

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州 510300）

采用分光光度法測定了西洋菜的葉、莖中葉綠素含量，結(jié)合西洋菜的葉/莖質(zhì)量比，解決了西洋菜整體研究時取樣不均的問題。對西洋菜中葉綠素提取工藝進行了研究，確定了最佳提取工藝為：室溫下、提取3次、每次提取時間40min、液固比5∶1。本研究表明超聲波處理會降低提取的葉綠素含量，但不會引起波長掃描圖譜形狀的改變。

西洋菜，葉綠素，超聲波，正交實驗法

西洋菜又名水菜、豆瓣菜等，引進我國已有100多年的歷史，在廣東、廣西等省栽培較多，一般作為蔬菜直接食用，口感嫩脆，深受人們喜愛。西洋菜適宜的生長溫度為15～25℃，立春之后栽培的西洋菜由于溫度高，品質(zhì)變差，口感老粗，不受人們喜愛，除部分被作為飼料外，大多數(shù)被拋棄于田埂，有待開發(fā)[1]。西洋菜色澤深綠，富含葉綠素，是較好的葉綠素來源。有關(guān)西洋菜中葉綠素提取的研究尚未見報道。本研究測定了西洋菜中葉、莖的葉綠素含量，采用乙醇提取法提取葉綠素，確定了優(yōu)化的提取工藝，并初步探討了超聲波對于西洋菜中葉綠素提取工藝的影響，以期為西洋菜中葉綠素資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋菜 購于學(xué)校附近的農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇分析純。

S22PC型可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司；JJ500型精密電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；HS6150型超聲波清洗儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋菜中葉綠素提取工藝 選取新鮮、無變黃的西洋菜，用蒸餾水沖洗干凈，瀝干，分別收集葉、莖。將葉、莖剪碎放到研缽中，小心研磨至變成泥狀。根據(jù)實驗需要，分別稱取0.8g葉、4g莖、4g葉莖混合物（葉∶莖=1∶3，m/m）樣品于小燒杯中。加入無水乙醇，研磨均勻后放到暗處靜置提取，之后過濾到50mL或100mL容量瓶中，進行1～3次提取、過濾，用無水乙醇定容、搖勻，取樣進行葉綠素含量測定。

1.2.2 葉綠素提取的單因素實驗研究

1.2.2.1 不同提取溶劑對葉綠素提取效果的影響 選用乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚、丙酮4種溶劑作為提取溶劑，稱取4g西洋菜樣品4份，分別加30mL提取溶劑，研磨均勻后放到暗處靜置提取，提取時間為30min，提取2次。過濾，收集濾液，測定葉綠素含量。

1.2.2.2 不同提取溫度對葉綠素提取效果的影響 稱取4g西洋菜樣品5份，分別加入30mL無水乙醇，分別在室溫、30、40、50、60℃條件下提取30min，提取次數(shù)為2次。過濾，收集濾液，測定葉綠素含量。

1.2.2.3 不同提取時間對葉綠素提取效果的影響 稱取4g西洋菜樣品5份，各加入30mL無水乙醇，分別在室溫條件下提取10、20、30、40、50min，提取次數(shù)為2次。過濾，收集濾液，測定葉綠素含量。

1.2.2.4 不同液固比對葉綠素提取效果的影響 稱取4g西洋菜樣品5份，按液固比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1加入無水乙醇，分別在室溫條件下提取30min，提取次數(shù)為2次。過濾，收集濾液，測定葉綠素含量。

1.2.2.5 不同提取次數(shù)對葉綠素提取效果的影響 稱取4g西洋菜樣品，按液固比4∶1加入無水乙醇，在室溫條件下提取30min。過濾，收集濾液，為第1次提取液，測定其葉綠素含量。取濾渣再次進行第2次、第3次提取，測定其提取液中葉綠素含量。

1.2.3 葉綠素提取的正交實驗研究 西洋菜中葉綠素提取工藝主要有三個影響因素，包括提取次數(shù)、提取時間、液固比。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實驗進行研究，因素水平見表1。

將西洋菜洗凈瀝干，葉莖分離，按葉∶莖=1∶3（質(zhì)量比）的比例取樣，用剪刀剪碎放到研缽中，研磨至泥狀，待用。稱取若干份樣品，每份樣品各4g。按表1的實驗安排處理樣品，過濾到50mL或100mL容量瓶中，用無水乙醇定容。再分別從提取液中移取2mL樣液到10mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋、定容。測吸光度值，計算提取的葉綠素含量。

表1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.4 超聲波輔助提取葉綠素研究 將西洋菜洗凈瀝干，葉莖分離，按葉∶莖=1∶3（質(zhì)量比）的比例取樣，用剪刀剪碎放到研缽中，研磨至泥狀，待用。稱取若干份樣品于小燒杯中，每份4g。各加20mL無水乙醇，放入超聲波清洗儀里進行超聲波處理，超聲波處理時間分別為0、10、20min。之后按照正交實驗的優(yōu)化工藝進行葉綠素提取，收集到100mL容量瓶中，定容。移取2mL樣液到10mL容量瓶中，用無水乙醇定容。測吸光度值，計算提取的葉綠素含量。

1.2.5 西洋菜中葉綠素含量測定 采用分光光度法測定西洋菜中葉綠素含量[2]。

移取2mL的樣品提取液至10mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻。將樣品稀釋液用1cm比色皿分別在波長645nm和663nm處測吸光度值。通過下述計算公式，計算出葉綠素含量，也就是每克樣品中提取出的葉綠素含量，用以表示提取效果。一般提取的葉綠素含量越高，表示提取效果越好。

式中：A645—樣品稀釋液在波長645nm時的吸光度；A663—樣品稀釋液在波長663nm時的吸光度；n—稀釋倍數(shù)；V—樣品溶液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 西洋菜不同部位的葉綠素含量測定

在研究中發(fā)現(xiàn)，每根西洋菜上的葉、莖質(zhì)量比是不同的，相差較大。若直接取少量西洋菜進行葉綠素提取研究，由于葉、莖比例不同，容易導(dǎo)致取樣不均，因此有必要檢測西洋菜中葉、莖的平均質(zhì)量比。取100g左右西洋菜，分別稱取其葉、莖質(zhì)量，可知西洋菜中葉的質(zhì)量為25%～30%，西洋菜的葉、莖平均質(zhì)量比近似為1∶3。因此，在后續(xù)西洋菜取樣時，都按照1∶3的質(zhì)量比稱取葉、莖，使得樣品具有代表性，也保證了葉綠素測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定。西洋菜中葉、莖綠色深淺差別大，反映西洋菜中葉、莖所含葉綠素含量相差較大，結(jié)果見表2。

表2 西洋菜中葉、莖的葉綠素含量Table 2 Chlorophyll content of leaf and caudex from watercress

由表2可見，西洋菜中葉、莖的葉綠素含量差別很大，西洋菜的葉片的葉綠素含量達到1.5426mg/g，遠高于西洋菜的莖的葉綠素含量（0.1174mg/g）。在西洋菜用于蔬菜汁飲料或提取葉綠素研究中，若選取西洋菜整體（葉、莖整體）進行研究，特別是取樣量較少時，則必須考慮葉、莖的葉綠素含量以及葉、莖質(zhì)量比的差異。本研究采用先確定西洋菜的葉、莖質(zhì)量比，再按比例稱取葉、莖，用以代表西洋菜整體，可以較好地解決取樣不均的問題。

2.2 不同提取溶劑對葉綠素提取效果的影響

表3 不同提取溶劑對葉綠素提取效果的影響Table 3 Effect of extraction solvent on the chlorophyll content

葉綠素為脂溶性色素，一般采用有機溶劑進行提取。由表3可見，丙酮的提取效果最好，其次是無水乙醇、乙酸乙酯，最差的是石油醚。從結(jié)果可知，丙酮和無水乙醇的提取效果都較好，丙酮的提取效果略高于無水乙醇的，但是相對于丙酮而言，無水乙醇價格便宜、毒性低。綜合經(jīng)濟效益、安全的考慮，本研究選用無水乙醇作為提取溶劑。

2.3 不同提取溫度對葉綠素提取效果的影響

表4 不同提取溫度對葉綠素提取效果的影響Table 4 Effect of extraction temperature on the chlorophyll content

由表4可知，在室溫（25℃）下，所提取的葉綠素含量是最高的，可以達到0.4955mg/g。在室溫到30℃范圍內(nèi)，提取的葉綠素含量基本保持不變。之后隨著提取溫度升高，提取的葉綠素含量逐漸降低，50℃時達到最低點，60℃時略有上升。這說明葉綠素本身不穩(wěn)定，容易在較高溫度下，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變而發(fā)生破壞。有文獻提出采用較高的提取溫度提取葉綠素[3]，以加速葉綠素擴散速度，提高提取效率；其實葉綠素不穩(wěn)定，不宜采用提高提取溫度的方法。因此，本研究提取溫度采用室溫。

2.4 不同提取時間對葉綠素提取效果的影響

由圖1可見，在10～30min以內(nèi)隨著提取時間的延長，西洋菜中葉綠素提取量逐漸增加，30min時達到最大值，之后葉綠素提取量開始略微降低，這可能是由于葉綠素不穩(wěn)定而部分分解有關(guān)。因此在葉綠素提取中，提取時間不宜過長，且應(yīng)注意避光，以減少葉綠素破壞。

圖1 不同提取時間對葉綠素提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on the chlorophyll content

2.5 不同液固比對葉綠素提取效果的影響由圖2可見，隨著液固比增加，葉綠素提取量增加，達到4∶1時，葉綠素提取量穩(wěn)定下來。本研究采用乙醇作為提取溶劑，需要通過液固比來控制乙醇用量。葉綠素提取工藝中，主要目的是用盡可能少的乙醇用量達到盡可能大的葉綠素提取效果。此外，液固比過大，還會造成后續(xù)濃縮蒸餾費用的增加。因此，

圖2 不同液固比對葉綠素提取效果的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid to material on the chlorophyll content

確定液固比在3∶1～5∶1比較適宜。

2.6 不同提取次數(shù)對葉綠素提取效果的影響

圖3 不同提取次數(shù)對葉綠素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction times on the chlorophyll content

由圖3可見，隨著提取次數(shù)的增加葉綠素提取量增加，但增加幅度逐漸減少。同時也觀察到提取3次后，濾渣色澤明顯變淺，說明其中葉綠素提取較完全。為了較充分提取出西洋菜中的葉綠素，提取次數(shù)應(yīng)采用2～3次。

2.7 葉綠素提取的正交實驗研究

由表5可知，在西洋菜中葉綠素提取實驗中，第7號實驗的葉綠素提取率最高，可達0.5723mg/g，其組合為A3B1C3，即提取次數(shù)為3次，每次提取時間為20min，液固比為5∶1。對葉綠素含量結(jié)果進行極差分析，由極差（R）可知，影響因素的主次為：提取次數(shù)＞液固比＞提取時間，其中最大的影響因素是提取次數(shù)。

表5 西洋菜中葉綠素提取的正交實驗結(jié)果Table 5 The orthogonal experiments results of the extrating process of chlorophyll from watercress

根據(jù)表5的各個因素的k值，確定最優(yōu)組合為：A3B3C3，即提取次數(shù)3次、每次提取時間40min、液固比5∶1。按照該優(yōu)化工藝對西洋菜進行葉綠素提取研究，其提取的葉綠素含量達到0.6013mg/g，結(jié)果高于表5中的第7號實驗結(jié)果。通過該優(yōu)化工藝提取葉綠素后的樣品殘渣色澤為黃色，基本上沒有綠色，說明西洋菜中的葉綠素提取較為完全?？紤]到本研究為小試研究，主要目的是摸索西洋菜中葉綠素提取規(guī)律，確定提取工藝，故暫根據(jù)葉綠素含量最高的組合來選取最優(yōu)組合，今后進行中試研究時再考慮經(jīng)濟因素等進行優(yōu)化。

2.8 超聲波輔助提取葉綠素的研究

超聲波輔助提取葉綠素已有相關(guān)文獻報道，可以提高提取效率，縮短提取時間[3]，但西洋菜中葉綠素提取研究未見報道。本實驗采用超聲波輔助處理后，再按最優(yōu)提取工藝進行提取，初步探討超聲波輔助提取西洋菜葉綠素的可行性。

表6 超聲波處理對葉綠素含量的影響Table 6 Effect of treatment of ultrasonic waves on the chlorophyll content

由表6可知，在本實驗2.7部分的最優(yōu)提取工藝基礎(chǔ)上，增加超聲波處理10、20min后，相關(guān)樣品提取的葉綠素含量都比不進行超聲波處理的降低，而有的文獻報道超聲波提取可以顯著提高葉綠素提取率、縮短提取時間[4]。分析其原因可能是：a.超聲波處理過程中，樣品、溶劑量少，超聲波能量使得提取溫度升高，而葉綠素對熱不穩(wěn)定，本實驗的2.3部分已經(jīng)證實提取溫度高會破壞西洋菜中的葉綠素，使得提取的葉綠素含量降低。b.本實驗采用超聲波輔助處理后，再按本實驗2.7部分的最優(yōu)提取工藝進行提取，而最優(yōu)提取工藝進行提取西洋菜葉綠素較為完全，使得超聲波輔助提取在本實驗中效果不明顯。

圖4 對樣品進行不同超聲波處理后的吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of samples in different treatments of ultrasonic waves

對樣品使用紫外可見分光光度計進行波長掃描（波長500～800nm），結(jié)果見圖4。通過圖譜可知，超聲波處理10、20min的樣品與未超聲波處理樣品相比，圖譜形狀非常類似，出峰位置都一樣，沒有偏移；都在663nm處有最大吸收峰值，這也是葉綠素的特征吸收峰[5-6]；未超聲波處理樣品在663nm處峰值更高。由此可知，超聲波處理前后樣品的葉綠素結(jié)構(gòu)沒有改變，而僅僅是葉綠素的含量發(fā)生了改變。

3 結(jié)論

西洋菜的葉、莖的葉綠素含量差別較大。通過測定西洋菜的葉、莖中葉綠素含量，按照西洋菜的葉、莖的平均質(zhì)量比取樣，可以較好地解決西洋菜整體研究時取樣不均的問題。本研究對西洋菜中葉綠素提取工藝進行了初步探索，確定了最佳提取工藝為：室溫下、提取3次、每次提取時間40min、液固比5∶1。在實驗中，發(fā)現(xiàn)超聲波處理會降低提取的葉綠素含量，需要改變超聲波輔助提取方法，有待進一步研究。

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Study on extracting process of chlorophyll from watercress

WEI Qiang-hua，XIAN Cui-zhi，ZHANG Wei-zhu，YANG SHU-juan，PAN LI-hua
（Department of Food Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China）

The chlorophyll content of leaf and caudex from watercress was measured by spectrophotometer method.And weight ratio of leaf to caudex from watercress was measured in order to sample uniformly.The extracting process of chlorophyll from watercress was studied.The optimal conditions were as follows：extracting temperature was room temperature，extracting 3 times，extracting period was 40minutes，and the ratio of alcohol to watercress sample was 5∶1.The chlorophyll content of samples was decreased while the scanning spectrum did not changed by the treatment of ultrasonic waves.

watercress；chlorophyll；ultrasonic waves；orthogonal experiments

TS255.36

B

1002-0306（2012）11-0275-04

2011－08－30

魏強華（1978－），男，碩士，講師，研究方向：食品資源開發(fā)與利用。