李海方，張 濤，江 波，繆 銘，沐萬孟，吳保承，楊春霞，侯傳林

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

馬克斯克魯維酵母乳糖酶水解和轉移性質比較

李海方，張 濤，江 波*，繆 銘，沐萬孟，吳保承，楊春霞，侯傳林

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

主要對馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)產β－D－半乳糖苷酶的水解性質和轉移酶學性質進行了比較。對比發(fā)現溫度、pH、金屬離子以及葡萄糖和半乳糖濃度對該酶的兩種性質有不同影響，同時還研究了酶的動力學特性，以ONPG為底物，測得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的Km為0.51mmol/L，Vmax為0.532μmol/(mg protein·min)。以乳糖為底物，Km為0.56mmol/L，Vmax為0.31μmol/(mg protein·min)。這對研究生產低聚半乳糖有重要作用。

馬克斯克魯維酵母，β－D－半乳糖苷酶，水解性質，轉移性質

低聚半乳糖(GOS)是由2～10個半乳糖基和葡萄糖基通過糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖［1］，作為母乳組成成分之一，它能夠選擇性促進人體腸道內益生菌的增殖［2］，有抑制腐敗菌生長［3］、減少有害代謝產物形成、防止便秘等功效，同時它還具有低甜度、低能量［4］、抗齲齒、對熱和酸穩(wěn)定等特性［5］。β－D－半乳糖苷酶屬于水解酶(EC3.2.1.23)，能夠催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，該酶還可以催化半乳糖基轉移反應，生成低聚半乳糖［6］。目前生產低聚半乳糖的方法，主要是通過微生物發(fā)酵產β－D－半乳糖苷酶，以乳糖為底物利用酶的轉移活性來合成產物［7－8］。不同微生物產的酶在水解和轉移方面有不同的性質［9－12］，本實驗研究了馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的水解和轉移活性，并進行了比較，從而為下一步合成低聚半乳糖反應提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、半乳糖、鄰硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷(ONPG)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、EDTA 國藥集團化學試劑有限公司。

Agilent1200高效液相色譜儀 配有Shodex RI－101示差折光檢測器和 M740數據處理器，美國Agilent公司;高壓細胞破碎儀 英國Constant System公司;恒溫水浴鍋 華利達實驗設備公司;722E型分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)及酶的提取 種子培養(yǎng)基:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，乳糖20 g/L，pH6.5。

將馬克斯克魯維酵母接入種子培養(yǎng)基在30℃，200 r/m in條件下培養(yǎng)15h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1%，同樣條件下培養(yǎng)15h發(fā)酵產酶。發(fā)酵結束后6000r/min離心得到菌體，將菌體用pH7.0 0.1mol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液重懸后用高壓細胞破碎儀在4℃30KPSI條件下破碎菌體;8000 r/m in下離心20m in取上清液即得到粗酶液。向粗酶液中加入30%硫酸銨靜置4h后，8000r/min離心除去雜蛋白，再向體系中繼續(xù)添加硫酸銨至濃度為80%，4℃靜置10h后離心得到酶蛋白沉淀。沉淀用少量緩沖液溶解后透析48h除掉其中的銨離子。透析好的酶液通過DEAE－Sepharose fast flow離子交換柱除掉一部分雜蛋白，再通過Superdex 75 Prep Grade凝膠柱分離得到酶蛋白。收集的酶蛋白在SDS－PAGE上顯示為單一條帶，即得到的是純的β－D－半乳糖苷酶。將收集的純酶液濃縮，用于研究酶學性質。

1.2.2 β－D－半乳糖苷酶水解活力測定方法 配制1mg/m L的ONPG溶液，取2m L溶液于35℃保溫10m in后加入酶液0.5m L，在35℃下準確反應15m in，加入2.5m L濃度為0.15mol/L Na2CO3溶液終止反應，溶液靜置2m in后，于420nm處測定吸光值，根據標準曲線算出酶活。1m L酶液1m in催化ONPG生成1μmol鄰硝基酚(ONP)為一個單位酶活。

1.2.3 β－D－半乳糖苷酶轉移酶活測定方法 用pH7.0的0.1mol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液配制0.5mol/L的底物乳糖溶液，取400μL底物溶液加入100μL酶液在40℃條件下準確反應4h后于沸水中煮沸5min終止反應。每分鐘產生1μmol低聚半乳三糖為一個酶活力單位。

1.2.4 低聚半乳三糖檢測方法 高效液相色譜法(HPLC):Agilent1200系列，配有Shodex RI－101示差折光檢測器和 M740數據處理器;色譜柱，Shodex Asahipak NH2P－50;流動相，乙睛∶水=68∶32，流速1m L/m in;柱溫30℃;進樣量10μL。

1.2.5 酶學性質測定方法

1.2.5.1 溫度對酶水解和轉移酶活及穩(wěn)定性的影響

將酶在不同溫度下與ONPG和乳糖反應，測定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對酶活力。考察不同溫度對酶水解酶活和轉移酶活的影響。

將酶在不同溫度(30～50℃)下保溫10、20、30、60、120m in，測定酶活力，通過相對酶活的比較，考察溫度對酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.2 pH對酶水解和轉移酶活及穩(wěn)定性的影響

將酶在不同pH下與ONPG和乳糖反應，測定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對酶活力?？疾觳煌琾H對酶水解活力和轉移酶活的影響。

將酶置于不同pH得磷酸緩沖液中，35℃保溫30m in，測定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對酶活力?？疾觳煌琾H對酶水解酶活和轉移酶活的影響。

1.2.5.3 金屬離子對β－D－半乳糖苷酶水解和轉移酶活的影響 酶液先經含有10mmol/L EDTA的Tris－HCl緩沖液于4℃透析12h以去除溶液中帶有的金屬離子;然后再經不含EDTA的Tris－HCl緩沖液于4℃透析48h以去除殘留EDTA;最后在處理過的酶液中分別加入不同的二價金屬離子及化合物(K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Fe2+、EDTA)使得其終濃度為10mmol/L。分別測定水解酶活和轉移酶活，以未加金屬離子或化合物的酶液活力為100%。

1.2.5.4 葡萄糖和半乳糖對酶水解和轉移酶活的影響 向底物中分別加入濃度為 0.05、0.1、0.2和0.4mol/L的葡萄糖和半乳糖，以不添加測得的酶活力為100%，其他條件下的酶活力與其比較換算成相對酶活?？疾炱咸烟呛桶肴樘菍γ杆饷富詈娃D移酶活的影響。

1.2.5.5 乳糖酶動力學參數測定 以ONPG為底物，分別配制1～8.33mmol/L不同濃度的溶液，在35℃測定酶活，按雙倒數作圖法(Lineweaver－Burk法)求米氏常數Km和最大反應速度Vmax。

2 結果與分析

2.1 溫度對乳糖酶水解和轉移酶活及穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解活力在35℃時最大，而轉移酶活力在40℃時最大，當溫度＞45℃時，酶的轉移活力迅速降低。生產低聚半乳糖的酶反應過程主要依靠酶的轉移性質，酶的轉移活力高時，低聚半乳糖轉化率會明顯提高，而水解酶活高時會增加反應副產物葡萄糖和半乳糖的產量，低聚半乳糖轉化率會降低。因此在生產低聚半乳糖的酶反應過程中，應該以轉移酶活的最適條件為首要考慮因素。

圖1 溫度對酶水解和轉移酶活的影響Fig.1 Effect of temperature on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase

由圖2可知，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在35～40℃之間保溫1h，水解酶活力和轉移酶活力能保持80%以上，隨著溫度升高時間延長，酶活力會持續(xù)降低。溫度達到50℃時，酶水解活力損失較快，保溫3h后殘余水解酶活為37%，殘余轉移酶活為20%。

圖2 溫度對酶水解和轉移酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.2 Curve of thermal stability on the enzyme

2.2 pH對酶水解和轉移活性及穩(wěn)定性的影響

由圖3可以看出，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在pH7.0的條件下酶水解和轉移酶活最高，轉移酶活對pH敏感性比水解酶活弱一些，在6.5～7.0的范圍內能保持較高活性。低聚半乳糖pH呈酸性，在合成反應中，pH會不斷下降，因此pH要控制在保持酶活力的范圍內。

圖3 pH對酶水解和轉移酶活的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase

由圖4可以看出，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶轉移酶活在pH6.0～7.0之間穩(wěn)定性比水解酶活高，而當pH＞7.0時轉移酶活迅速降低，而水解酶活降低較緩慢。在合成低聚半乳糖的反應中，要保持較高的轉移活性，因此酶在處理過程中pH要控制在6.5～7.0之間，防止酶轉移活性降低。

圖4 pH對酶水解和轉移酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase’s stability

2.3 金屬離子對β－D－半乳糖苷酶水解和轉移活性的影響

由圖5可知 Ni2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、EDTA在酶反應體系中使馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的轉移活性完全失去;Mn2+、K+使得酶轉移活力降低了50%以上，Co2+使酶轉移活力降低了20%，Na+使酶轉移活力降低了10%。Mg2+對酶轉移活力有激活作用，相對酶活為125%。EDTA、Cu2+能夠使酶活力完全喪失;Na+、Ni2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Co2+使水解酶活降低了50%以上，K+對酶水解活力沒有影響，Mg2+對酶水解活力有激活作用。在合成低聚半乳糖的反應中，需要酶有較高的轉移活力，Ni2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、EDTA會是反應的強烈抑制劑，而向體系中加入適當濃度的Mg2+可以減少酶用量。實驗結果表明Na+能夠抑制酶的水解活力，而對轉移酶活影響較小，在合成低聚半乳糖的反應中，可以利用這一性質進行研究，減少水解反應副產物含量提高低聚半乳糖轉化率。

2.4 葡萄糖和半乳糖對酶水解和轉移活性的影響

圖5 金屬離子對酶活性的影響Fig.5 Effect ofmetal ions on enzyme activity

由圖6可以看出，當添加葡萄糖量大于0.1mol/L時可以促進乳糖酶的水解活性，而添加半乳糖則會抑制β－D－半乳糖苷酶水解活性，且濃度越大抑制力越強。這樣可以看出在合成低聚半乳糖的反應中，反應產物半乳糖會抑制反應向水解方向進行。

圖6 葡萄糖和半乳糖對乳糖酶水解酶活的影響Fig.6 Effect of glucose and galactose on hydrolysis activity

由圖7可以看出，添加葡萄糖會抑制乳糖酶的轉移酶活，且添加量越大抑制力越強。添加半乳糖對轉移酶活影響較小，添加量為0.05mol/L時乳糖酶轉移酶活增加。反應前期，未添加半乳糖的反應，需要利用β－D－半乳糖苷酶的水解活性先將乳糖水解，得到半乳糖后再進行轉移反應得到低聚半乳糖。而在反應體系中添加半乳糖，半乳糖作為反應的底物，可以通過酶的轉移活力迅速反應合成低聚半乳糖。

圖7 葡萄糖和半乳糖對乳糖酶轉移酶活的影響Fig.7 Effect of glucose and galactose on transgalactose activity

2.5 β－D－半乳糖苷酶的動力學參數

根據圖8顯示的線性回歸方程，可以求得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在以ONPG為底物時，Vmax為 0.532μmol/(mg protein·m in)、Km為0.51mmol/L。

根據圖9顯示的線性回歸方程，可以求得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在以乳糖為底物時，Vmax為 0.31μmol/(mg protein·m in)、Km為 0.56 mmol/L。

圖8 以ONPG為底物乳糖酶的Lineweaver－Burk圖Fig.8 Lineweaver－Burk plots of the enzyme using ONPG as substrate

圖9 以乳糖為底物乳糖酶的Lineweaver－Burk圖Fig.9 Lineweaver－Burk plots of the enzyme using lactose as substrate

3 結論

3.1 馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解酶活最適溫度為35℃，轉移酶活最適溫度為40℃，溫度大于45℃時酶轉移活力損失較快。該酶的水解和轉移酶活力最適pH相同，均為7.0，但pH穩(wěn)定性略有不同，水解酶活在pH6.5～8.0范圍內較穩(wěn)定，轉移酶活在6.5～7.0范圍內較穩(wěn)定。

3.2 Mg2+對馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解酶活和轉移酶活均有激活作用，Na+能夠抑制酶的水解活力，而對酶轉移活力影響較小。

3.3 葡萄糖對馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的水解活力有促進作用，對酶轉移活性有抑制作用。半乳糖抑制酶的水解作用，低濃度(0.05mol/L)的半乳糖能夠促進酶的轉移活性而濃度繼續(xù)增加對酶轉移活性幾乎沒有影響。

3.4 以ONPG為底物，測得馬克斯克魯維酵母β－D－半 乳 糖 苷 酶 的 Km為 0.51mmol/L，Vmax為0.532μmol/(mg protein·m in)。以乳糖為底物，Km為0.56mmol/L，Vmax為0.31μmol/(mg protein·min)。

［1］Van Loo J，Cummings J，Delzenne N，et al.Functional food properties of non－digestible oligosaccharides:A consensus report from the ENDO project(DGXIIAIRII－CT94－1095)［J］.British Journal of Nutrition，1999，81(2)，121－132.

［2］Roberfroid M.Prebiotics:The concept revisited［J］.Journal of Nutrition，2007，137(3)，830－837.

［3］Macfarlane G T，Steed H，Macfarlane S.Bacterialmetabolism and health－related effects of galacto－oligosaccharides and other prebiotics［J］.Journal of Applied Microbiology，2008，104(2): 305－344.

［4］Valli C，Traill W B.Culture and food:A model of yoghurt consumption in the EU［J］.Food Quality and Preference，2005，16 (4):291－304.

［5］Crittenden R G，Playne M J.Properties and applications of food－grade oligosaccharide trends［J］.Food Science ＆Technology，1996(6):126－130.

［6］Nakakuki T.Oligosaccharide production，properties and applications［M］.Gorden and Breach Science Publisher，1993.

［7］Tomomatsu H.Health effects of oligosaccharides［J］.Food Technology，1994(13):205－260.

［8］Wallenfels K.Enzymatische synthese von oligosacchariden aus disacchariden［J］.Naturwissenschaften，1951，38(13):306.

［9］Bruins M E，Strubel M，Van Lieshout J F T，et al. Oligosaccharide synthesis by the hyperthermostableβ－glucosidase from Pyrococcus furiosus:Kinetics and modeling［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，33(1):3－11.

［10］Boon M A，Janssen A E M，Van der Padt A.Modelling and parameter estimation of the enzymatic synthesis of oligosaccharides byβ－galactosidase from Bacillus circulans［J］. Biotechnology and Bioengineering，1999，64(5):558－567.

［11］Iwasaki K I，Nakajima M，Nakao S I.Galactooligosaccharide production from lactose by an enzymic batch reaction usingβ－galactosidase［J］.Process Biochemistry，1996，31 (1):69－76.

［12］Kim C S，Ji E S，Oh D K.A new kinetic model of recombinantβ－galactosidase from Kluyveromyces lactis for both hydrolysis and transgalactosylation reactions［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，316(3):738－743.

Com parison ofβ－D－galactosidase hydrolysis and transgalacosidation properties from Kluyverom yces marxianus

LIHai－fang，ZHANG Tao，JIANG Bo*，M IAO M ing，MU W an－meng，WU Bao－cheng，YANG Chun－xia，HOU Chuan－lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

This research comparedβ－D－galactosidase’s hyd rolytic and transg lucosidation p roperties fromKluyveromycesmarxianus.The com parison ind icated d ifferent tem perature，pH，metal ions g lucose and galactose concentration had d ifferent effec t onβ－D－galac tosidase’s hyd rolysis and transgalac tose ac tivity.This paper also studied the dynam ics of the enzyme.Taking ONPG as substrate，the Kmwas 0.51mmol/L，and the Vmaxwas 0.532μmol/(mg p rotein·m in).Taking lac tose as substrate，the Kmwas 0.56mmol/L，and the Vmaxwas 0.31μmol/ (mg p rotein·m in).All these studies can p lay an im portant role in p roducing GOS.

Kluyveromycesmarxianus;β－D－galactosidase;hyd rolysis;transgalactosidation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0243－04

2011－09－26 *通訊聯系人

李海方(1986－)，女，碩士，研究方向:應用酶技術。

科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金(10C26213201021)。