黃 律，龍進學，張宏彪，袁世山，，徐大為，劉婷婷

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.南京農(nóng)業(yè)大學，南京 21009; 3.勃林格殷格翰動物保健,北京 100004）

豬細小病毒4型是2009年由美國科學家發(fā)現(xiàn)的一種新型細小病毒，根據(jù)基因組分析目前暫將其歸入細小病毒科，細小病毒亞科，博卡病毒屬[1]。博卡病毒屬最早由牛細小病毒（BPV）和犬微小病毒（CMV）組成。因為一般細小病毒都只有2個開放閱讀框（ORFs），而BPV和CMV具有第3個開放閱讀框，所以將其單獨歸入新的屬，并取宿主牛和犬的英文單詞前2個字母組成BoCa（博卡）病毒的名稱。PPV4與BoCa病毒一樣具有3個ORFs[1-2]。

近2年來，許多型的豬博卡病毒被不斷發(fā)現(xiàn)[3-6]，關于PPV4乃至其他型豬博卡病毒的研究目前還都僅停留在流行病學調(diào)查和序列分析。人博卡病毒最早于2005 年被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)分離到病毒，但還尚未確定其致病性[7]。從目前人博卡病毒的臨床病例分析來看，成人博卡病毒IgG的陽性率高達94.2%；人博卡病毒主要感染8歲以下兒童，特別是嬰兒；人博卡病毒陽性患兒絕大多數(shù)都存在呼吸道以及腸道疾病[8-12]。應用熒光定量PCR對人博卡病毒進行檢測發(fā)現(xiàn)人博卡病毒存在于人體多種器官，糞便、呼吸道樣本以及血清中檢出率較高，而定量檢測發(fā)現(xiàn)通常在血清中博卡病毒含量較高[13-17]。

本研究基于本實驗室已經(jīng)建立優(yōu)化的Taqman熒光定量PCR技術[18]，對試驗豬攻毒PPV4陽性血清，初步了解攻毒后試驗豬的癥狀、血清中病毒DNA拷貝數(shù)的變化、各器官病理變化及病毒含量，并且嘗試運用陽性血清富集PPV4病毒粒子。

1 材料與方法

1.1 試驗豬與陽性病料

試驗豬為35日齡未閹割長白斷奶仔豬，經(jīng)嚴格挑選，選取體重與健康狀況一致，PPV4為陰性的試驗豬6頭。用于動物試驗的PPV4陽性病料JS0910，JS0909，JS0918均由本實驗室收集、鑒定和保存。試驗豬和陽性病料在實驗前均確保豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、偽狂犬病毒均為陰性。

1.2 儀器和試劑

主要儀器有Realplex4熒光定量PCR儀（Eppendorf），病料自動研磨器（拓夫機電科技）。DNA提取試劑盒（TIANGENE公司，DP315），熒光定量PCR2×HSTaqMIX（上海睿安生物技術公司），日立HP-900電子顯微鏡。

1.3 引物和探針的設計合成

根據(jù)GenBank 上公布的PPV4全基因組序列（GQ387500、GQ387499）以及本實驗室擴增的國內(nèi)PPV4全基因組序列（GU978964-GU978968,HM031134.1-HM031135.1），選取VP基因中的特異性保守序列設計引物和TaqMan探針，上游引物：5'-TGGTGGTCAAGTATCTGTGCC-3'，下游引物：5'-TTGCTTTTG GATGTCC-TGGT-3'，探針序列：5'-Fam-CCAAACAGCGGC TTCGTGC-Tamara-3'。引物和探針均由上海睿安生物技術公司合成。

1.4 病毒DNA的提取

動物實驗結(jié)束后解剖試驗豬，無菌收集臟器，稱重，按1∶1(mL∶ mg)加入PBS進行研磨。組織樣品研磨液與血清樣品反復凍融3次后，12 000 r/min離心，吸取上清液用于病毒核酸的提取，采用天根公司的病毒DNA提取試劑盒。

1.5 Taqman 熒光定量 PCR 反應

Taqman 熒光定量PCR反應參考本實驗室已建立的檢測方法[18]進行：Realtime-PCR 總體系為 25μL，其中2×HS Taq 12.5μL，上、游引物(10 μM)各0.5μL，探針(10μM)0.5μL，模板2μL，余下用滅菌ddH2O 補足。反應條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 S，60 ℃ 40 S并采集熒光強度，進行40個循環(huán)。

Taqman 熒光定量PCR擴增曲線：y =-3.478x + 41.26，R2=0.998，擴增效率：0.94。

1.6 動物實驗

選擇35日齡的未閹割的長白小豬6頭，分3組進行動物實驗。每組都有一公一母2頭試驗豬，2組接毒，1組作為陰性對照。重復本實驗2次。

選取PPV4陽性病料（血清）（DNA拷貝數(shù)約 105/μL）JS0910，JS0909，JS0918各10 mL，混合后12 000 r/min離心15 min取上清，過0.22μm的濾器以除去細菌雜質(zhì)。接種病料制備好后立即接種實驗豬：接種方式為頸部肌肉多點注射，每只試驗豬注射PPV4陽性血清5 mL。此后每日觀察試驗豬的運動、呼吸、采食和飲水，每4天采血一次并測量體溫（直腸）。在試驗豬血清PPV4陽轉(zhuǎn)開始，分別在攻毒后第8、16、24天和30天分別處死1頭豬。收集每只試驗豬的血清；之后將試驗豬進行剖解，觀察各臟器的病理變化，無菌收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、扁桃體、子宮、睪丸、腹部淋巴結(jié)、胃、大腸、小腸、氣管、腦等組織器官以及肺部灌洗液。按照1∶1（mL∶mg）加入無菌PBS將上述病料進行研磨，取上清，提取DNA后進行Real-timePCR檢測，換算出每毫克實驗豬各組織中病毒的拷貝數(shù)。

1.7 PPV4病毒粒子觀察

剖殺PPV4陽性豬時，用大燒杯收集盡可能多的豬血，隨后立即使用50 mL離心管5 000 r/min離心10 min，吸取上清-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取PPV4陽性血清150 mL置于離心管中，平衡后4 ℃ 9 000 g離心30 min，取出離心管肉眼可見離心管底部明顯的白色沉淀。小心倒出上清，置于離心管中平衡后4 ℃9 000 g離心30 min，此時離心管底部已經(jīng)很難看見明顯的白色沉淀。吸取上清進行超速離心：將上清置于3個超離專用離心管中，每個約可加38 mL，將液體加滿至離心管的上沿約2～3 mm，小心蓋上離心管蓋子，放入離心機確認無誤后關閉離心機艙蓋，等待溫度降至4 ℃及抽真空完成后160 000 g離心3 h。3 h后肉眼可見離心管底部有少量的沉淀，病毒顆粒在此沉淀中。棄去上清，將3管離心管中的沉淀每管用13 mL的STE緩沖液進行小心吹打，使其徹底溶于緩沖液中，3管合并為1管。配置25%的蔗糖溶液5 mL加于一只新的離心管底，將含病毒粒子的緩沖液小心翼翼加到蔗糖上部，加的時候不可破壞蔗糖溶液，加完液體之后保持蔗糖溶液和緩沖液的分層。將離心管加滿至離離心管的上沿約2～3 mm，如首次超離，超離160 000 g 2 h，小心取出離心管，棄去上清，將病毒粒子用1 mLSTE緩沖液懸浮，用電鏡放大2 000倍后觀察。

2 結(jié)果

2.1 試驗豬攻毒后的臨床變化及剖解病變

試驗豬攻毒PPV4后未出現(xiàn)死亡，但攻毒豬相對于陰性對照豬生長速度明顯減緩，被毛粗亂。攻毒豬攻毒1 d后即出現(xiàn)大量流涕，咳嗽以及大聲喘氣等癥狀，攻毒14 d后咳嗽和喘氣癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，20 d后流涕癥狀也逐漸消除。采食、飲水和排泄均正常。測量體溫發(fā)現(xiàn)實驗豬在攻毒后的第4天體溫略升高1～2 ℃，此后趨于正常。

對死亡豬進行剖解發(fā)現(xiàn)大部分豬全身淋巴結(jié)腫大，特別是腸系膜淋巴結(jié)腫大明顯（見圖1）部分肺臟呈現(xiàn)淤血（見圖2），有一頭豬還出現(xiàn)肝臟周邊組織梗死，其他臟器均未見明顯肉眼病變。

圖1 腸系膜淋巴結(jié)腫大

圖2 肺臟部分淤血

2.2 TaqMan熒光PCR對試驗豬組織中病毒的檢測

對試驗豬攻毒的30 d內(nèi)試驗豬體內(nèi)PPV4 DNA的拷貝數(shù)呈明顯的消長曲線，大約在接毒后8 d左右病毒的含量達到最高峰，拷貝數(shù)約為107/μL，隨后病毒的含量逐漸開始下降，到接毒30 d后病毒含量已經(jīng)下降到104左右（見圖3）。陰性對照豬均未檢測到PPV4 DNA。

對試驗豬進行剖解，收集器官進行組織嗜性研究發(fā)現(xiàn)病毒在各個器官均有分布，含量相差在100倍以內(nèi)，說明PPV4可能存在于多種器官。不同時間處死的PPV4陽性豬各器官中PPV4 DNA拷貝數(shù)也略有不同，相差在10倍以內(nèi)。進一步分析發(fā)現(xiàn)前期病毒含量在扁桃體以及肺臟含量較高，后期在腸道、胃部以及泌尿道的含量開始上升，最終腸道和泌尿器官部分的病毒含量最高（見圖4）。陰性對照豬各器官均未檢測到PPV4 DNA。

2.3 PPV4 病毒粒子電鏡觀察

用電子顯微鏡20 000倍觀察,觀察視野中可見一些類似于細小病毒大小的顆粒，大小約20～30 nm。（見圖5）

3 討論

近幾年豬場斷奶前仔豬頻發(fā)頑固性腹瀉，特別是2011年春季，由于腹瀉導致了大量仔豬的死亡。一些研究報道認為這可能與豬博卡病毒感染有關，從本實驗來看豬博卡病毒可能并非其元兇。PPV4感染的試驗豬在前期主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀：例如流涕、咳嗽，但在感染2周后這些癥狀消失，PPV4陽性豬生長速度明顯慢于陰性豬，未見類似于人博卡病毒感染所致的腸道癥狀[8-17]；PPV4陽性豬的飲水、采食以及運動均正常。說明PPV4的致病性可能并非致死性，主要影響豬的生產(chǎn)性能。

對試驗豬注射PPV4陽性血清后可產(chǎn)生病毒血癥，血清中病毒DNA含量呈現(xiàn)明顯的消長曲線，病料接種試驗豬8 d后體內(nèi)的PPV4DNA含量達到高峰。同欄舍的實驗豬在8 d后能夠感染PPV4說明PPV4也具有傳染性，并且傳染速度較快，從飼養(yǎng)情況來看很可能通過接觸傳播以及糞口傳播，這一點與人博卡病毒現(xiàn)有的傳播途徑的推測一致[8-12]。

從試驗豬各器官的病理變化來看，主要病變?yōu)榉闻K淤血以及全身淋巴結(jié)腫大，特別是腸系膜淋巴結(jié)。當然從實驗的條件來看，這也不能斷定就一定是由PPV4引起。從試驗豬的各組織器官的病毒DNA含量來看，病毒可能首先攻擊試驗豬的呼吸器官和免疫器官：肺臟和扁桃體，隨后攻擊腸道以及泌尿器官。這一點與試驗豬前期的呼吸道癥狀吻合，病毒最后對試驗豬的腸道以及泌尿道器官的侵害可能也并不是非常強烈，因為試驗豬并未出現(xiàn)腸道癥狀，這可能使得PPV4病毒可以通過腸道以及泌尿道不斷向外排毒，導致了其他豬的感染。

本次試驗的結(jié)果也只是對PPV4的初步研究和探討，欲知道其確切的致病機理和危害等還需更為科學嚴格的動物試驗，及分離到PPV4,以及采用SPF豬進行動物試驗等。

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