王 旭，李美珍，盧 欣，房志仲

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

奧美拉唑（omeprazole,OMZ）為苯并咪唑類(lèi)質(zhì)子泵抑制劑（PPIs），可抑制胃壁細(xì)胞膜內(nèi)質(zhì)子泵（H+-K+-ATP酶系）[1]。臨床用于胃十二指腸潰瘍、反流性食管炎、卓-艾綜合征以及急性消化性潰瘍出血的治療[2]。由于奧美拉唑在酸性環(huán)境下易降解[3]，目前國(guó)內(nèi)上市的奧美拉唑大多是腸溶制劑，采用腸溶包衣保護(hù)藥物免遭胃酸破壞?！吨袊?guó)藥典》2010年版（二部）收載奧美拉唑的含量測(cè)定方法為HPLC法，C8柱，流動(dòng)相為0.01mol/LNa2HPO4（用稀磷酸調(diào)pH至 7.6）-乙腈（75∶25）[4]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第18冊(cè)奧美拉唑腸溶膠囊的測(cè)定方法[5]，C18柱，選擇甲醇-水-磷酸-三乙胺（65∶35∶0.12∶0.3）為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。參照藥典（C8-乙腈體系）和新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（C18-甲醇體系），進(jìn)行方法摸索，得到C8-甲醇體系。本試驗(yàn)比較3種分析方法有無(wú)差異。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國(guó)Spectra-physics公司），Spectra Focus紫外檢測(cè)器（美國(guó)Spectraphysics公司），Kromasil-C18柱，Kromasil-C8柱，輸液泵 SP8810，Anstar色譜工作站，ZDY-…-1IKVA高精密度單相交流穩(wěn)壓器（國(guó)營(yíng)啟東電訊廠(chǎng)），電子分析天平（賽多利斯），80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)），KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 奧美拉唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：100367-201104）；A 廠(chǎng)家（奧美拉唑腸溶膠囊，20mg/粒，批號(hào)：1110030）；B 廠(chǎng)家（奧美拉唑腸溶片，10mg/片，批號(hào)：008110401）；C 廠(chǎng)家（奧美拉唑鎂腸溶片，20mg/片，批號(hào)：NE11093）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水自制。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

1.3.1.1 C8-乙腈體系：色譜柱：TIANHE誖C8柱（200 mm×46mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01mol/LNa2HPO4-乙腈（65∶35），用稀磷酸調(diào) pH 至 8.0；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：302 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.1.2 C8-甲醇體系：色譜柱：TIANHE誖C8柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）； 流 動(dòng) 相 ：0.01 mol/L Na2HPO4-甲醇（45∶55），用稀磷酸調(diào) pH 至 8.0；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：302 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.1.3 C18-甲醇體系：色譜柱：TIANHE誖C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸-三乙胺（60∶40∶0.12∶0.3）；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：302 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.1.4 系統(tǒng)適用性：分別在3個(gè)體系中，對(duì)照品及制劑中，奧美拉唑的峰形對(duì)稱(chēng)、分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不小于4 000。

1.3.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)取奧美拉唑?qū)φ掌?0mg，置于100mL量瓶中，加甲醇稀釋定容，搖勻，得到奧美拉唑儲(chǔ)備液200μg/mL。量取儲(chǔ)備液1mL于10mL量瓶中，分別于3個(gè)體系下加流動(dòng)相稀釋至刻度，得到對(duì)照品溶液20μg/mL。

1.3.3 供試品溶液配制 分別在3種方法體系下，取奧美拉唑腸溶片/膠囊，去膠囊殼，研細(xì)稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于奧美拉唑2mg）于50mL量瓶中，用流動(dòng)相超聲10min溶解，稀釋至刻度，取適量3 000 r/min離心5min，取上清液5mL置于10mL量瓶中用流動(dòng)相稀釋定容。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別在3種方法體系下，分別量取“1.3.2”項(xiàng)下200μg/mL儲(chǔ)備液0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50mL 置于 10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容搖勻，得到 2、5、10、15、20、25、30μg/mL的奧美拉唑系列溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別精密量取20μL進(jìn)樣，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.5 精密度試驗(yàn) 分別在3種方法體系下，取同一份對(duì)照品溶液，分別按“1.3.2”項(xiàng)下方法配制，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)6次進(jìn)樣，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.3.6 穩(wěn)定性考察 分別在3種方法體系下，取同一份對(duì)照品溶液，分別按“1.3.2”項(xiàng)下方法配制，分別于 0、3、6、9、12、24 h，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.3.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別在3種方法體系下，取同一批次（A廠(chǎng)家，批號(hào)1110030）樣品6份，分別按“1.3.3”項(xiàng)下方法配制，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取奧美拉唑腸溶膠囊A，除去囊殼研細(xì)稱(chēng)取約22.69mg（約相當(dāng)于奧美拉唑2mg），9份，精密稱(chēng)定，置于50mL量瓶中，分別按照80%、100%、120%的量，加入“1.3.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液 0.8、1、1.2mL，按“1.3.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.9 含量測(cè)定 分別在3種方法體系下，按“1.3.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別測(cè)定3批，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析[6]，比較3種分析方法是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性 3種不同體系下對(duì)照品和制劑的色譜圖見(jiàn)圖1、2。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 按“1.3.4”項(xiàng)下條件測(cè)定，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程如下：

結(jié)果表明：分別在3種不同方法體系下，奧美拉唑濃度在2.00～30.00μg/mL范圍內(nèi)與峰面積A成良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 3種不同方法體系下RSD分別為 0.26%、0.57%、0.54%（C8-乙腈體系、C8-甲醇體系、C18-甲醇體系），均小于2.0%，符合中國(guó)藥典2010年版二部附錄ⅥD的規(guī)定，表明這3種不同方法，精密度均良好。

2.4 穩(wěn)定性考察 3種不同方法體系下分別于0、3、6、9、12、24 h 后進(jìn)樣，RSD 分別為 0.88%、1.19%、1.08%（C8-乙腈體系、C8-甲醇體系、C18-甲醇體系），表明在3種不同體系下，奧美拉唑溶液均24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 3種不同方法體系下RSD分別為 0.51%、0.82%、0.64%（C8-乙腈體系、C8-甲醇體系、C18-甲醇體系），均小于2.0%，表明這3種方法重現(xiàn)性均良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

2.6.1 C8-乙腈體系 平均回收率為100.36%（RSD=0.88%，n=9），平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（C8-乙腈體系）Tab1 Resultsof recovery test（C8-acetonitrile system）

2.6.2 C8-甲醇體系 平均回收率為100.91%（RSD=0.61%，n=9），平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(C8-甲醇體系)Tab2 Resultsof recovery test(C8-methanolsystem)

2.6.3 C18-甲醇體系 平均回收率為100.51%（RSD=1.09%，n=9），平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 分別在3種方法體系下，對(duì)3個(gè)廠(chǎng)家的奧美拉唑腸溶片/膠囊進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4～6。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（C18-甲醇體系）Tab 3 Results of recovery test（C18-methanolsystem）

表4 C8-乙腈體系3廠(chǎng)家產(chǎn)品中奧美拉唑含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)Tab4 Results of content determination of omeprazole from 3 manufacturersby C8-acetonitrilesystem(n=3)

表5 C8-甲醇體系3廠(chǎng)家產(chǎn)品中奧美拉唑含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)Tab5 Resultsof content determ ination of omeprazole from 3 m anufacturersby C8-m ethanolsystem(n=3)

表6 C18-甲醇體系3廠(chǎng)家產(chǎn)品中奧美拉唑含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)Tab6 Resultsof content determination of omeprazole from 3 manufacturersby C18-methanolsystem(n=3)

2.7.2 含量測(cè)定結(jié)果比較 見(jiàn)表7。

表7 不同體系下奧美拉唑含量測(cè)定結(jié)果比較Tab7 Comparison of determ ination of om eprazole of 3 different system s

方差分析結(jié)果顯示，P>0.05，A、B、C 3 個(gè)廠(chǎng)家的奧美拉唑在3種不同體系下含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

3 討論

3.1 奧美拉唑在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性 有文獻(xiàn)報(bào)道奧美拉唑在堿性環(huán)境下穩(wěn)定，pH<8，穩(wěn)定性下降[7-8]。分別配置一系列pH環(huán)境的奧美拉唑溶液考察其穩(wěn)定性[9]。在C8-甲醇體系下，以流動(dòng)相溶劑，1%磷酸調(diào)節(jié)pH的流動(dòng)相為稀釋劑，得到pH為8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5 的一系列奧美拉唑溶液。結(jié)果顯示，在室溫下，pH4.5，pH5極不穩(wěn)定，在0 h進(jìn)樣出現(xiàn)雜質(zhì)峰，即奧美拉唑被破壞；pH5.5 在 2 h 時(shí)出現(xiàn)雜質(zhì)峰；pH6、pH6.5，pH7，pH7.5在8 h內(nèi)穩(wěn)定；pH8.0 2 d內(nèi)穩(wěn)定；pH8.5 3 d內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 奧美拉唑在不同母液中的穩(wěn)定性 選擇甲醇、乙腈和流動(dòng)相作為溶劑配制母液。在C8-甲醇體系下，精密量取母液1mL至10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容。每24 h，重新量取不同溶劑母液，用流動(dòng)相稀釋?zhuān)M(jìn)樣。試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲醇母液和pH8.0的流動(dòng)相母液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；乙腈母液3 d內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 3個(gè)測(cè)定體系的比較 《中國(guó)藥典》2010年版（二部）和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第18冊(cè)奧美拉唑腸溶膠囊對(duì)奧美拉唑含量測(cè)定方法分別為C8-乙腈體系、C18-甲醇體系。在具體試驗(yàn)過(guò)程中，綜合考慮試劑毒性、試驗(yàn)成本等問(wèn)題，C8-乙腈體系中用甲醇替代乙腈進(jìn)行流動(dòng)相摸索，確定C8-甲醇體系，即 0.01mol/L甲醇（45:55），用稀磷酸調(diào)pH至8.0。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在3種色譜條件中，奧美拉唑的保留時(shí)間均在10min左右，奧美拉唑含量測(cè)定在C8-乙腈體系與C8-甲醇體系中無(wú)顯著性差異，乙腈與甲醇相比較，毒性更大且成本更高，故未進(jìn)行C18-乙腈體系試驗(yàn)研究。在進(jìn)行制劑含量測(cè)定試驗(yàn)時(shí)，同一廠(chǎng)家同一批號(hào)的奧美拉唑制劑在C8-乙腈、C8-甲醇、C18-甲醇3體系中的測(cè)定結(jié)果是一致的，無(wú)顯著性差異，即3個(gè)方法無(wú)顯著性差異。而A廠(chǎng)家的含量測(cè)定結(jié)果明顯低于B、C兩廠(chǎng)家，可能由于不同廠(chǎng)家使用藥物原料藥來(lái)源不同，生產(chǎn)過(guò)程中使用的輔料、配方、生產(chǎn)工藝等因素存在差異。

3.4 樣品預(yù)處理 奧美拉唑腸溶片分別進(jìn)行除去腸溶衣后研細(xì)稱(chēng)樣以及不除去腸溶衣直接研細(xì)稱(chēng)樣，進(jìn)樣后色譜圖無(wú)顯著性差異，腸溶衣不干擾奧美拉唑測(cè)定，因此處理過(guò)程不除去腸溶衣直接研細(xì)稱(chēng)量。

3.5 其他 3種不同含量測(cè)定方法無(wú)顯著性差異，但C8柱與C18柱相比，使用壽命短，成本高。流動(dòng)相體系中，與甲醇相比，乙腈的毒性大、成本高。因此從試驗(yàn)操作人員的自身安全與試驗(yàn)成本等方面綜合考慮，優(yōu)先考慮使用C18-甲醇體系。

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