尹靜文 ，宋麗明 ，王杏林

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津藥物研究院，釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

格列美脲鹽酸二甲雙胍復(fù)方片屬于固定劑量組成的復(fù)方制劑，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)上市品。臨床研究證實(shí)，鹽酸二甲雙胍與格列美脲聯(lián)合用藥能有效控制血糖，并能分別降低鹽酸二甲雙胍與格列美脲的毒副作用[1-5]。因此開(kāi)發(fā)該復(fù)方制劑對(duì)提供一種療效確切、安全方便且副作用小的治療糖尿病的藥物顯得十分重要?，F(xiàn)有的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，《美國(guó)藥典》第34版[8]及文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]中，僅有對(duì)鹽酸二甲雙胍或格列美脲單一成分的質(zhì)量控制方法。在格列美脲鹽酸二甲雙胍復(fù)方片有關(guān)物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，由于鹽酸二甲雙胍量占比例較大，其色譜峰拖尾嚴(yán)重；且除由原料中引入的雜質(zhì)外，還會(huì)產(chǎn)生一種特定雜質(zhì)（本文中稱(chēng)為雜質(zhì)X）。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，已有文獻(xiàn)方法均不適合格列美脲鹽酸二甲雙胍復(fù)方片中格列美脲雜質(zhì)的檢測(cè)。鑒于此，有必要對(duì)格列美脲鹽酸二甲雙胍復(fù)方片中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行研究，以制定嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保證新研發(fā)的復(fù)方制劑質(zhì)量的可控性，從而確保用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），Thermo Fishier LCQAdvantage Max離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀，XS205型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），Anke TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)），SK5200H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），F(xiàn)E20/EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥 格列美脲對(duì)照品（批號(hào)：100674-200901中國(guó)藥品生物制品檢定所）；4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-2氧-3-吡咯啉-1-甲酰氨基]乙基]苯磺酰胺基甲酸乙酯(命名為雜質(zhì)1，批號(hào)：100781-200901中國(guó)藥品生物制品檢定所)；4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-2氧-3-吡咯啉-1-甲酰氨基]乙基]苯磺酰胺（命名為雜質(zhì)2，批號(hào)：100675-200901中國(guó)藥品生物制品檢定所）；格列美脲原料（含量：99.97%批號(hào)：GL2011021重慶賽維藥業(yè)有限公司）；格列美脲鹽酸二甲雙胍復(fù)方片（自制，規(guī)格：格列美脲1mg-鹽酸二甲雙胍 400mg，批號(hào)：GR-1，GR-2，GR-3）；乙腈（色譜純，天津市康科德色譜試劑公司）；氨水（分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；磷酸二氫鈉（分析純，天津市岡船化學(xué)試劑科技有限公司）；純凈水（娃哈哈純凈水）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB C18column（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液為6.4mmol/L磷酸二氫鈉，用氨試液調(diào)pH至6.8，A相為乙腈-磷酸鹽緩沖液=35∶65，B相為乙腈-磷酸鹽緩沖液=65∶35，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；進(jìn)樣量：20μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab1 Procedureof gradientelution by HPLC

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 格列美脲對(duì)照溶液：取格列美脲對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈溶解并定容，配成濃度為0.2mg/mL的溶液。

1.3.2.2 雜質(zhì)貯備液：取雜質(zhì)1、雜質(zhì)2對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈溶解并定容，配制成濃度均為0.2mg/mL的溶液。

1.3.2.3 雜質(zhì)對(duì)照溶液：精密量取雜質(zhì)貯備液，用乙腈稀釋200倍，配制成雜質(zhì)1、雜質(zhì)2濃度均為1μg/mL的溶液。

1.3.2.4 供試品溶液：取供試品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于格列美脲1mg），置離心管中，精密加入5mL乙腈，15～20℃水溫下，超聲，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

1.3.2.5 格列美脲自身對(duì)照溶液：取供試品溶液用乙腈稀釋200倍，配制成格列美脲濃度約為1μg/mL的溶液。

1.3.2.6 空白溶液：按處方量，取全輔料及鹽酸二甲雙胍粉末置離心管中，精密加入5mL乙腈，15～20℃水溫下，超聲，搖勻，離心，取上清液作為空白溶液。

1.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取供試品粉末適量（約相當(dāng)于格列美脲10mg），加入25mL乙腈，15～20℃水溫下超聲，搖勻，離心，取上清液，60℃加熱放置1 h后，取5mL置10mL容量瓶中，另加入雜質(zhì)貯備液50μL，用乙腈稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖。

1.3.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 強(qiáng)制降解試驗(yàn)及溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品粉末適量，按“1.3.2.4”項(xiàng)方法配制成供試品溶液。將供試品溶液經(jīng)以下條件處理：（1）酸：加0.1moL/L鹽酸溶液適量，搖勻，放置0.5 h，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液中和，離心，取上清液測(cè)定。（2）堿：加0.1moL/L氫氧化鈉溶液適量，搖勻，放置0.5 h，用0.1moL/L鹽酸溶液中和，離心，取上清液測(cè)定。（3）氧化：加30%雙氧水適量，搖勻，放置0.5 h，離心，取上清液測(cè)定。（4）光照：于4 000 Lx強(qiáng)度下照射3 h后測(cè)定。（5）加熱：于60℃烘箱中放置0.5 h、1 h后取出，放至室溫測(cè)定。（6）避光室溫下放置1 h、3 h后測(cè)定。（7）避光冷藏放置3 h后測(cè)定。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：精密移取“1.3.2.1”項(xiàng)下格列美脲對(duì)照溶液 20、30、40、50、60、80、100 μL，至10mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成格列美脲線(xiàn)性系列溶液。另精密移取“1.3.2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)貯備液 20、30、40、50、60、80、100 μL，至 10mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成雜質(zhì)線(xiàn)性系列溶液，按“1.3.1”項(xiàng)方法測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積。

1.3.4.3 定量限及最小檢出限試驗(yàn)：分別將格列美脲對(duì)照溶液和雜質(zhì)貯備液稀釋?zhuān)谏鲜錾V條件下，按信噪比（S/N）為10∶1計(jì)算定量限，按信噪比（S/N）為3∶1計(jì)算最小檢出限。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品粉末適量6份（約相當(dāng)于格列美脲 1mg），照“1.3.2.4”和“1.3.2.5”項(xiàng)下方法分別平行配制格列美脲供試品溶液和自身對(duì)照溶液各6份，另取“1.3.2.3”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照溶液，按“1.3.1”項(xiàng)方法測(cè)定。按外標(biāo)法計(jì)算已知雜質(zhì)含量，按自身對(duì)照法計(jì)算未知雜質(zhì)含量。

1.3.4.5 回收率試驗(yàn)：取供試品粉末適量（約相當(dāng)于格列美脲10mg），加入25mL乙腈，15～20℃水溫下超聲，搖勻，離心，取上清液作為供試品貯備液。分別移取“1.3.2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)貯備液 40、50、60 μL 各3份到10mL量瓶中，分別加5mL供試品貯備液，用乙腈稀釋至刻度，作為回收率溶液；按“1.3.1”項(xiàng)法測(cè)定。按外標(biāo)法計(jì)算。

1.3.5 供試品測(cè)定 取GR-1、GR-2、GR-3批供試品，照“1.3.2.4”和“1.3.2.5”項(xiàng)下方法分別配制格列美脲供試品溶液和自身對(duì)照溶液，另取“1.3.2.3”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算已知雜質(zhì)含量，按自身對(duì)照法計(jì)算未知雜質(zhì)含量。

1.3.6 雜質(zhì)X歸屬研究 將強(qiáng)制降解試驗(yàn)中熱破壞1 h供試品溶液進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)，HPLC-MS條件為：流動(dòng)相：0.1%醋酸緩沖液，用氨試液調(diào)pH至 4.0，A 相為乙腈-醋酸緩沖液=40∶60，B 相為乙腈-醋酸緩沖液=70∶30，梯度洗脫條件見(jiàn)表2；柱溫：30 ℃；流速：0.4mL/min；離子化模式：ESI，分析模式：正離子模式；毛細(xì)管溫度：250℃；噴霧電壓：4.5 KV，毛細(xì)管電壓：25 V；鞘氣流速：35 arb，輔助氣流速：20 arb。

表2 HPLC-MS梯度洗脫程序Tab2 Procedureof gradientelution by HPLC-MS

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，格列美脲、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)X分離度均大于2.0，按格列美脲峰計(jì)算理論塔板數(shù)不低于5 000，符合要求。

2.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn)及溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，供試品溶液在酸、堿、氧化條件下基本穩(wěn)定，在加熱及長(zhǎng)時(shí)間放置后雜質(zhì)2、雜質(zhì)X有較大程度增長(zhǎng)。

表3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)及溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab3 Forced degradation testing and solution stability testing results

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 以峰面積A為縱坐標(biāo)，以濃度C為橫坐標(biāo)（μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到格列美脲、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2的線(xiàn)性回歸方程（n=7）：格列美脲：A=65 064 c+3 130.9 r=0.999 8 ；雜質(zhì) 1：A=85 937 c-1 988.9 r=0.999 7；雜質(zhì) 2：A=100 235 c-2 609.5 r=0.999 8。結(jié)果表明，格列美脲在0.41～2.22μg/mL，雜質(zhì)1在0.42～2.51μg/mL，雜質(zhì)2在0.45～2.04μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4 定量限及最小檢出限試驗(yàn) 格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的定量限分別為3.18、2.05和2.04 ng。格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的最小檢出限分別為0.955 、0.615 、0.612 ng。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 雜質(zhì)1未檢出；雜質(zhì)2含量為0.03%，RSD為0.55%；雜質(zhì)X含量為0.01%，RSD為0.31%；其它雜質(zhì)總和為0.19%，RSD為0.41%。符合藥典規(guī)定，重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn) 雜質(zhì)1、雜質(zhì)2回收率分別為99.75%和99.81%，RSD分別為0.43%和0.61%（n=9）。

2.7 供試品測(cè)定 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 供試品與格列美脲原料中格列美脲有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Tab4 Testing results for related substance

2.8 雜質(zhì)X歸屬研究 格列美脲和雜質(zhì)X的HPLC-MS圖見(jiàn)圖2。格列美脲分子量為491.04，雜質(zhì)X分子量為422.89。

3 討論

提取溶劑及提取條件的選擇：格列美脲在乙腈中溶解性較好，在水中溶解性差，而鹽酸二甲雙胍在水中易溶，在乙腈中溶解性較差，為減少鹽酸二甲雙胍對(duì)測(cè)定的干擾，選擇乙腈作為提取溶劑。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，乙腈作為溶劑，不干擾測(cè)定。由于格列美脲對(duì)熱不穩(wěn)定，故需控制超聲溫度，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，超聲溫度在15～20℃條件下，可控制雜質(zhì)增長(zhǎng)。

流動(dòng)相的選擇：根據(jù)《美國(guó)藥典》（第34版）[8]格列美脲有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，流動(dòng)相為6.4mmol/L磷酸二氫鈉，用稀磷酸調(diào)pH至2.5～3.0，乙腈-磷酸鹽緩沖液=50∶50。按該條件測(cè)定，格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2保留時(shí)間分別為28.12min、5.35min和4.16 min，但本復(fù)方制劑中由于鹽酸二甲雙胍量過(guò)大，色譜峰拖尾嚴(yán)重，保留時(shí)間為0～3.4min，且試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，本復(fù)方制劑的新增雜質(zhì)X，保留時(shí)間為3.68min，與雜質(zhì)2無(wú)法達(dá)到基線(xiàn)分離，干擾雜質(zhì)2的測(cè)定。故考慮通過(guò)改變緩沖液pH值和流動(dòng)相比例，解決上述問(wèn)題。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)緩沖液pH值調(diào)整至6.0～7.0 時(shí)，雜質(zhì) 2 保留時(shí)間為 8.25～8.35min，雜質(zhì)X保留時(shí)間為3.78～3.85min，雜質(zhì)X與雜質(zhì)2分離良好；當(dāng)pH=6.8時(shí)，主峰對(duì)稱(chēng)性最好。當(dāng)緩沖液pH=6.8，比例提高到65%時(shí)，雜質(zhì)X保留時(shí)間為4.88min，雜質(zhì)2保留時(shí)間為10.54min，鹽酸二甲雙胍及輔料峰保留時(shí)間為0～3.58min，三者達(dá)到良好分離。但該條件下，格列美脲保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨乙腈比例增加，主峰出峰時(shí)間明顯縮短，當(dāng)乙腈比例大于60%時(shí)，主峰出峰時(shí)間較適宜。因此考慮采用梯度洗脫方法解決此問(wèn)題。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，各雜質(zhì)峰均能達(dá)到良好分離，主峰出峰時(shí)間適宜，雜質(zhì)洗脫完全。

雜質(zhì)X歸屬研究：復(fù)方制劑中新生雜質(zhì)的來(lái)源可能為：（1）原料之間相互作用。（2）原輔料間相互作用。（3）制劑工藝及儲(chǔ)存過(guò)程引發(fā)的降解產(chǎn)物。要對(duì)新生雜質(zhì)進(jìn)行歸屬和限度測(cè)定，需進(jìn)行原料相容性試驗(yàn)、原輔料相容性試驗(yàn)、制劑工藝考察和穩(wěn)定性考察[11]。本試驗(yàn)中分別按處方量將格列美脲原料藥、格列美脲和鹽酸二甲雙胍原料混合物、格列美脲與輔料、供試品（GR1，GR2，GR3）放置于高溫、高濕、強(qiáng)光下考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料混合物，在高溫條件下不穩(wěn)定，除雜質(zhì)2外，新增雜質(zhì)X約為1.0%。而供試品在高溫條件下放置后，雜質(zhì)X增長(zhǎng)遠(yuǎn)小于原料混合物。推測(cè)雜質(zhì)X可能由格列美脲和鹽酸二甲雙胍原料間相互作用而產(chǎn)生，當(dāng)通過(guò)制劑工藝減少兩種原料的直接接觸后，雜質(zhì)X增長(zhǎng)很小。根據(jù)HPLC/MS一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)的分子離子峰及碎片信息（圖2），雜質(zhì)X分子量為423。格列美脲酰胺鍵易斷裂，斷裂后分子量為352,而鹽酸二甲雙胍胍基易與其它部分?jǐn)嗔裑12]，胍基斷裂后剩余部分分子量為71，由此進(jìn)一步推測(cè)雜質(zhì)X可能為格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料相互作用結(jié)果。

綜上所述，采用該色譜條件，復(fù)方制劑中各雜質(zhì)均能有效分離，可用于復(fù)方格列美脲鹽酸二甲雙胍片中格列美脲有關(guān)物質(zhì)，特別是雜質(zhì)X，雜質(zhì)2的控制。通過(guò)HPLC-MC檢測(cè)，推測(cè)雜質(zhì)X可能為格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料相互作用的產(chǎn)物。

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