李文玉，金日龍，胡興越

PKH 26標(biāo)記的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在阿爾茨海默病大鼠中的遷移

李文玉1，金日龍2，胡興越1

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江杭州310016;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科，浙江杭州310003)

目的：研究熒光染料PKH26標(biāo)記的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSC)在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，以下簡稱AD)大鼠中的遷移。方法：抽取正常人骨髓，體外分離培養(yǎng)BM-MSC;以PKH26標(biāo)記第5代BM-MSC，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSC表面標(biāo)記物，并在熒光顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記率;將PKH26標(biāo)記的BM-MSC尾靜脈注射到正常對(duì)照組和AD動(dòng)物模型組，14天后在大鼠海馬區(qū)，用熒光顯微鏡觀察PKH26標(biāo)記的BM-MSC細(xì)胞。利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較AD模型組和BM-MSC移植組空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSC表面標(biāo)記物CD73和CD105呈陽性，在體外BM-MSC的PKH26標(biāo)記率達(dá)100%。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較BM-MSC移植組和AD動(dòng)物組，BM-MSC移植組在第13、14天時(shí)空間學(xué)習(xí)記憶能力比AD動(dòng)物組有顯著改善。在移植BM-MSC的大鼠海馬區(qū)可發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記的BM-MSC陽性細(xì)胞，與DAPI吻合。PKH26陽性細(xì)胞在AD動(dòng)物模型組明顯多于正常對(duì)照組。結(jié)論：BM-MSC不僅能通過AD大鼠的血腦屏障，而且存活在AD大鼠的海馬區(qū)，并有能夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)障礙。

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞;骨髓細(xì)胞;阿爾茨海默病;PKH26

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):659-664.］

阿爾茨海默病癡呆(Alzheimer's disease，AD)是一組病因未明的原發(fā)性、退行性腦變性疾病。AD發(fā)病多數(shù)起病隱匿，神經(jīng)元逐漸消失死亡，難于預(yù)防和阻止其惡化。目前，對(duì)于AD患者的治療尚無特殊方法。有研究表明，人類臍帶血干細(xì)胞治療AD動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞能改善認(rèn)知功能［1］，但是臍帶血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用存在一定的倫理上和安全性的問題，臨床上很難自體移植，移植時(shí)需要用免疫抑制劑。而骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)來源廣泛，取材容易，體外迅速擴(kuò)增，不存在倫理學(xué)問題，可運(yùn)用自體移植，解除宿主可能的免疫排斥反應(yīng)［1］。已研究證明，在腦血管病及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中起到神經(jīng)保護(hù)及抗炎作用［2-5］。盡管BM-MSC的移植取得了一些進(jìn)展，但對(duì)BMMSC移植到AD的研究甚少，其BM-MSC能否通過血腦屏障到達(dá)AD顱內(nèi)，并存活在顱內(nèi)等尚有爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)利用PKH26標(biāo)志BM-MSC的方法，追蹤BM-MSC能否到達(dá)AD大鼠顱內(nèi)，探討B(tài)M-MSC在AD大鼠顱內(nèi)的分布形式及存活時(shí)間，為BM-MSC治療AD的可能性奠定良好的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BM-MSC培養(yǎng) 抽取正常人骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液(ficoll-hypaue)密度梯度離心分離法分離單核細(xì)胞。分離的單核細(xì)胞用10%FBS(fetal bovine serum)和 含 有 1%的penicillin/streptomycin的 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle`s medium)培養(yǎng)，4 h后棄去未貼壁細(xì)胞，經(jīng)過3～4天的休眠后迅速增殖。細(xì)胞使用0.05%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA，在37℃放置5 min從培養(yǎng)皿壁中分離，之后重新放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后再分離。培養(yǎng)5～6代后形態(tài)趨于一致，MSCs形態(tài)呈纖維樣，呈紡錘狀，可形成均勻的集落。用流式細(xì)胞儀鑒定MSCs表面標(biāo)志物，細(xì)胞表面蛋白如CD105和CD73呈陽性，而CD34和CD45標(biāo)記則呈陰性。

1.2 PKH26標(biāo)記BM-MSC 取生長狀態(tài)良好的第5代BM-MSC，以0.25% 胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液。離心、洗滌細(xì)胞，加0.5 ml稀釋劑C重懸細(xì)胞，制備濃度為2×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。按PKH26染色說明書操作。立即在離心管內(nèi)配制4×10-6mol/L的PKH26染料應(yīng)用液0.5 ml，將上述MSCs懸液快速加至染料中，立即用吸管混勻。25℃無菌條件下孵化5 min，期間輕柔翻轉(zhuǎn)離心管以確?；靹?加1 ml FBS終止染色，混勻后25℃孵化1 min，再加2 ml含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基稀釋終止后的樣品，同上法離心10 min;棄上清，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至另一離心管，用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基洗滌3次;重懸細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，分別放入1 ml注射器，一部分放置蓋玻片的培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)數(shù)天。

1.3 建立AD動(dòng)物模型及BM-MSC移植 30只健康SD雄性大鼠(3月齡，300 g左右)隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、AD模型組和BM-MSC移植組。每組各10只，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心)飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AD模型組，經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后，立體定向儀固定頭部，備皮消毒，沿顱頂中線作2 cm切口，分離骨膜暴露頭骨，與前囟向后3.0 mm，中線左右各旁開2.2 mm處，用牙科鉆打開顱骨，利用微量注射器垂直進(jìn)針2.8 mm，將1μl溶液緩慢注入，注射時(shí)間為5 min，留針5 min。AD模型組注射聚合的 Aβ1-40(sigma，美國)1 μl，Aβ1-40使用前用無菌生理鹽水稀釋成10μg/μl，37℃孵育1周，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。正常對(duì)照組注入(同上)生理鹽水1μl。造模后第5天開始，連續(xù)3天用水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選學(xué)習(xí)記憶能力下降的大鼠，BM-MSC移植組和正常對(duì)照組尾靜脈注射PKH26標(biāo)記的1×106BM-MSC 1 ml，AD模型組尾靜脈注射生理鹽水1 ml。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) AD動(dòng)物模型利用水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試空間學(xué)習(xí)記憶能力［6］，測(cè)試前1天進(jìn)行進(jìn)行水中適應(yīng)訓(xùn)練。模型制備后第5天(連續(xù)3天)和BM-MSC移植后第10天(連續(xù)5天)所有組動(dòng)物均進(jìn)行Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)，放入不銹鋼圓形水池中，使其自由游泳，自動(dòng)攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，設(shè)定60 s為最長逃避潛伏期，60 s后自動(dòng)停止記錄。每只動(dòng)物每天進(jìn)行2次，取平均值。所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，兩組間比較用ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 免疫組化觀察 進(jìn)行BM-MSC移植的大鼠，14天后均予以處死。首先經(jīng)大鼠心臟，用生理鹽水灌注沖洗循環(huán)血液，然后用4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液進(jìn)行灌注和固定?？焖偃〕龃竽X，放入4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液，在4℃環(huán)境中放置12 h，然后放入30%蔗糖溶液中。使用冰凍切片方法制作冠狀切片(厚度為30μm)，進(jìn)行免疫組化染色。使用PBS洗滌3次切片，細(xì)胞核染色用DAPI(用PBS 1∶100稀釋)放置5 min，再用PBS洗滌3次，封片后用激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察DAPI陽性細(xì)胞和PHK26標(biāo)記的BM-MSC。

2 結(jié)果

2.1 BM-MSC培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 在體外培養(yǎng)BM-MSC呈梭狀、漩渦樣生長，排列緊密。傳代5～6代的BM-MSC利用流式檢測(cè)均表達(dá)高水平的干細(xì)胞標(biāo)記物。其CD73(平均98%，波動(dòng)在97.4% ～98.8%之間)和 CD105(平均90.3%，波動(dòng)在83.1% ～96.4%)表達(dá)陽性，CD34和 CD45陰性，符合其干細(xì)胞的特征性抗原表達(dá)(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSC的標(biāo)記物Fig.1 Flow cytometric analysis of BM-MSC markers

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 造模后第5天，AD模型組逃避潛伏期比對(duì)照組延長，造模后第7天的實(shí)驗(yàn)中，AD模型組逃避潛伏期比對(duì)照組明顯延長(P＜0.05，圖2a)，說明AD模型組空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。BM-MSC移植組和AD模型組在第10天開始行水迷宮試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，但模型組大鼠逃避潛伏期在第2、3、4、5日明顯長于正常對(duì)照組，BM-MSC移植組逃避潛伏期在第4、5日比AD模型組明顯縮短(圖2b)。這表明AD模型大鼠學(xué)習(xí)獲取能力受損，而BM-MSC移植能夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3 體外標(biāo)記BM-MSC細(xì)胞結(jié)果 熒光鏡下，PKH26標(biāo)記1天的MSCs，可見細(xì)胞膜周圍均勻分布的明亮紅色熒光。標(biāo)記率達(dá)100%(圖3)。隨著時(shí)間延長，熒光逐漸進(jìn)行性減弱，標(biāo)記率不斷下降，2周時(shí)，少數(shù)MSCs觀察不到熒光。

圖2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察AD大鼠逃避潛伏期的變化Fig.2 The escape latency of AD rats in the Morris water maze task

2.4 PKH26標(biāo)記的BM-MSC在AD大鼠中的遷移 在AD大腦海馬區(qū)切面上可見PKH26標(biāo)記的BM-MSC的遷移，與細(xì)胞核染色的DAPI細(xì)胞雙標(biāo)吻合(圖4a～c)。在AD大鼠腦組織(如大腦皮質(zhì)、海馬、基底節(jié)區(qū)、室管膜區(qū)等)均能觀察到許多被PKH26標(biāo)記的BM-MSC移植細(xì)胞。在正常對(duì)照組，在海馬區(qū)也能觀察到PKH26標(biāo)記的BM-MSC陽性細(xì)胞(圖4d～f)其陽性細(xì)胞極少，與AD模型組比較有顯著的差異。這表明通過尾靜脈注射的MSC能在AD大鼠腦組織存活、遷移和分化。與正常對(duì)照組比較，BM-MSC不僅能通過AD大鼠的血腦屏障且主要分布在受損的海馬區(qū)。

3 討論

本研究中培養(yǎng)的BM-MSC經(jīng)過5～6代傳代，其細(xì)胞形態(tài)及性質(zhì)物無明顯改變，用流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志鑒定顯示，干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD73和 CD105呈90%以上陽性。CD34和CD45呈陰性。本實(shí)驗(yàn)利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD模型組的逃避潛伏期比正常對(duì)照組明顯延長，說明AD模型組大鼠學(xué)習(xí)空間能力顯著下降，從而證明造模成功。AD動(dòng)物移植BM-MSC 13、14天后，BM-MSC移植組逃避潛伏期比AD模型組顯著縮短，這可能與BM-MSC神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

移植細(xì)胞的活體示蹤在干細(xì)胞的研究中起到重要的作用，PKH26是一種紅色熒光染料，可通過脂肪鏈與細(xì)胞膜不可逆結(jié)合，可用于長期標(biāo)記，不改變細(xì)胞膜重要功能表面蛋白區(qū)，在適當(dāng)?shù)臉?biāo)記濃度下基本不影響細(xì)胞生長，標(biāo)記強(qiáng)度穩(wěn)定，具有良好的可重復(fù)性［7-10］。應(yīng)用PKH26標(biāo)記BMSCs研究表明，PKH26在一定濃度范圍內(nèi)不影響B(tài)MSCs的生長特性及分化能力［11-12］。本研究中，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PKH26標(biāo)記 BM-MSC在第1天標(biāo)記率很高(100%)，隨著時(shí)間的延長，熒光逐漸進(jìn)行性減弱，標(biāo)記率不斷下降，3周時(shí)，絕大多數(shù)MSCs觀察不到熒光。這可能與PKH26本身的熒光持續(xù)時(shí)間有關(guān)。

BMSCs在AD中的應(yīng)用甚少，MSC是否能通過血腦屏障到達(dá)AD大鼠顱內(nèi)還存在一些爭(zhēng)議。本研究用PKH26標(biāo)記BM-MSC的示蹤方法，觀察到在AD大鼠的海馬區(qū)有大量PKH26陽性細(xì)胞，且與DAPI陽性細(xì)胞吻合，說明尾靜脈注射的BM-MSC不僅能通過血腦屏障，還能存活在顱內(nèi)。在正常對(duì)照組大鼠顱內(nèi)雖能觀察到PKH26陽性細(xì)胞，但其數(shù)量甚少，這說明AD疾病會(huì)影響海馬神經(jīng)元消失，損傷的神經(jīng)元可能會(huì)起到趨化MSC的作用。這已在腦梗死及多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中證明過［2-3］。移植后21天，在AD大鼠海馬區(qū)仍然能觀察到PKH26標(biāo)記的 BM-MSC，表明 BM-MSC能在AD大鼠顱內(nèi)存活到21天以上，更長時(shí)間的觀察發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記的熒光很難判斷其細(xì)胞形態(tài)。這與體外觀察PKH26標(biāo)記的BM-MSC的熒光顯示時(shí)間吻合，說明PKH26標(biāo)記觀察BM-MSC在顱內(nèi)存活時(shí)間及分化為其他神經(jīng)元細(xì)胞有一定的限制。

綜上所述，應(yīng)用PKH26標(biāo)記BM-MSC簡便易行，示蹤觀察發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記細(xì)胞在AD動(dòng)物顱內(nèi)存活并主要分別在海馬區(qū)，與正常對(duì)照組有明顯差別。并且夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)障礙。但其機(jī)制尚不清楚。移植的BM-MSC在AD大鼠顱內(nèi)分化為神經(jīng)元?還是有抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用等有待進(jìn)一步研究。

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Migration of PKH26-labeled mesenchymal stem cells in rats with Alzheimer's disease

LI Wen-yu1，JIN Ri-long，HU Xing-yue1
(1.Department of Neurology，Sir Run Run Show Hospital，Zhejiang University，Hangzhou 310016，China;2.Department of Orthopedic Surgery，The First Affiliated Hospital，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310016，China)

Objective:To investigate the migration of fluorescent dye PKH26-labeled BM-MSC in the Alzheimer's model rats.Methods:Normal human bone marrow extracted for isolation of BM-MSC was cultured in vitro.The 5th passaged BM-MSC was labeled with PKH26，and observed under a fluorescence microscope for PKH26 labeling efficiency，and using flow cytometry BM-MSC surface markers was checked.The PKH26 labeled BM-MSC injected into the tail vein of the normal control group and ADanimal model group，14 days after finding the PKH26-labeled BM-MSC cells in the rat hippocampus using fluorescence microscopy.Using the Morris water maze experiment comparison of AD model and BM-MSC transplantation group of spatial learning and memory ability.Results:Flow cytometry showed BM-MSC surface markers CD73 and CD105 were positive.In vitro，PKH26-labeled rate of BM-MSC was100%.The Morris water maze experiment comparison of BM-MSC transplantation group and AD group of animals，BM-MSC transplantation group at 13，14 days of spatial learning and memory ability than AD animal group had significantly improved.14 days after BM-MSCs in rat hippocampus could be found which were PKH26-positive，consistent with DAPI staining.PKH26-positive cells in animal models of AD were significantly more than those in the normal control group.Conclusion:BM-MSC in AD rats not only migrates through the blood-brain barrier，but also mainly survives in the hippocampus of AD rats，and it can improve AD rat model of learning disabilities.

Mesenchymal stem cells;Bone marrow calls;Alzheimer's Disease;PKH26

R 749.16

A

1008-9292(2012)06-0659-06

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.009

2011-12-09

2012-02-03

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2090184);浙江省中醫(yī)藥局青年基金(2006Y005).

李文玉(1978-)，女，博士，主治醫(yī)師，從事神經(jīng)內(nèi)科工作.

胡興越(1962-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩導(dǎo)，從事神經(jīng)內(nèi)科工作;E-mail:huxingyue2003@126.com

［責(zé)任編輯 張榮連］