端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/h1>
2012-10-21 08:21:50張愈延
張愈延
端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/p>
張愈延1,2
（1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000）
評(píng)價(jià)端粒酶轉(zhuǎn)染對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響。將體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組，兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組和表皮生長因子組。培養(yǎng)30代后觀察傳代細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例的變化，檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)。兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組和表皮生長因子組增多，伸展貼壁能力增強(qiáng)，表型正常，G2~M期和S期細(xì)胞比例顯著增加，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)也較正常對(duì)照組增多。兔端粒酶轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖且表型正常，可以增強(qiáng)其伸展粘附能力和分泌功能，有利于防治角膜內(nèi)皮失代償。
端粒酶；基因轉(zhuǎn)染；角膜內(nèi)皮細(xì)胞；增殖
角膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常是維持角膜透明性的重要前提。在嬰幼兒，角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以進(jìn)行有絲分裂，但在成年后不再進(jìn)行有絲分裂。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其缺損區(qū)由鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞增大、擴(kuò)展和移行滑動(dòng)來填補(bǔ)覆蓋。所以，隨著年齡的增長，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度逐漸下降。當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度由于各種病損的作用低于某一臨界值時(shí)，發(fā)生角膜水腫和大泡性角膜病變，稱為角膜內(nèi)皮失代償。如何恢復(fù)成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力以及防治角膜內(nèi)皮失代償一直是眼科界的研究熱點(diǎn)。本研究依據(jù)細(xì)胞衰老的端粒假說，用兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討其?duì)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，以期恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力，為進(jìn)一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 pIRES2-增強(qiáng)性綠色熒光蛋白（EGFP）-rTERT正義熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
仿照文獻(xiàn)[1]所采用pIRES2-EGFP-人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）正義熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法和步驟操作，采用NotⅠ酶切法進(jìn)行連接方向性的鑒定。
1.2 貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)
取健康家貓新鮮眼球數(shù)只，用無菌PBS溶液沖洗干凈后，抗生素D-Hanks液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)浸泡30 min，按照參考文獻(xiàn)[2]所采用的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約100×106·L-1，每孔200 μL接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板每6孔為1組，分為3組，分別命名為端粒酶基因轉(zhuǎn)染組（A組）、正常對(duì)照組（B組）和表皮生長因子組（C組）；A組擬進(jìn)一步轉(zhuǎn)染rTERT，B組不作任何處理，C組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入表皮生長因子，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行飽和濕度培養(yǎng)。原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)36 h后換液1次。以后每2 d換液1次，備用。
1.3 rTERT導(dǎo)入原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞
采用Lipofectin試劑盒，通過脂質(zhì)體法，按照試劑盒操作說明和文獻(xiàn)[3]所采用的hTERT轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人類胚胎成纖維細(xì)胞的操作方法，在實(shí)驗(yàn)室條件下將rTERT轉(zhuǎn)染導(dǎo)入A組原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞中，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)。
1.4 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測
將轉(zhuǎn)染rTERT貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞（A組）繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，按照參考文獻(xiàn)[4]所介紹的方法處理后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞生長周期。同期、同條件下培養(yǎng)的B組和C組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞也按照相同操作方法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞生長周期。
1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
將培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細(xì)胞分別放在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化。
1.6 貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)
采用蛋白印跡法，對(duì)培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[5]所述的詳細(xì)步驟操作，進(jìn)行貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)量的檢測。當(dāng)正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT及貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP達(dá)90 %融合時(shí)，再參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行操作，擴(kuò)增后分別命名為貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞形態(tài)變化
倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，A組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，易于聚集成群，貼壁范圍較廣，細(xì)胞較大呈不規(guī)則形狀，部分呈六邊形，周邊細(xì)胞可見伸出偽足；B組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞較小，貼壁細(xì)胞較少，多呈圓形或橢圓形團(tuán)狀；C組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞也見增多，但細(xì)胞多呈懸浮狀態(tài)，貼壁較少，偽足不明顯。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，A組、C組細(xì)胞數(shù)量較B組增多更為明顯。
2.2 細(xì)胞生長周期變化
經(jīng)單因素方差分析，與B組相比，A組、C組G0~G1期(G0：靜止期；G1：DNA合成準(zhǔn)備期)細(xì)胞比例顯著下降（< 0.05），三組間兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）；與B組相比，A組、C組G2~M期(G2：DNA合成后期；M期：有絲分裂期)細(xì)胞比例顯著提高(< 0.05)，但A組和C組G2~M期細(xì)胞比例的變化(> 0.05)在α = 0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組相比，A組、C組S期(S期：DNA合成期) 細(xì)胞比例顯著提高(< 0.05)，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。
表1 兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染和表皮生長因子應(yīng)用對(duì)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例的影響
a> 0.05，A組、C組比較（單因素方差分析, SNK-檢驗(yàn)）
2.3 TERT蛋白和Ⅳ型膠原表達(dá)量的變化
蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP中均有TERT蛋白表達(dá)，但貓角膜內(nèi)皮-rTERT細(xì)胞中TERT蛋白表達(dá)量明顯高于貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并且開始有兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達(dá)。另外，貓角膜內(nèi)皮-rTERT細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)量較正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞及貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP也顯著增加。
3 討論
3.1 端粒酶結(jié)構(gòu)與貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的研究
端粒酶是一種特殊的核糖核酸蛋白質(zhì)聚合物，是依賴RNA的DNA聚合酶。Gryfe R等于1997年提出了細(xì)胞衰老的端粒假說，即細(xì)胞衰老和永生假說，這種假說認(rèn)為細(xì)胞衰老是端粒復(fù)制問題得不到補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果，端粒的縮短是正常體細(xì)胞老化的有絲分裂鐘，當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，即所謂的末端限制片段（TRF）的長度為5~7 kb時(shí)，就有信號(hào)指令細(xì)胞退出細(xì)胞周期，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細(xì)胞周期的G1期和G2PM期之間的某個(gè)時(shí)期，這時(shí)的細(xì)胞便進(jìn)入了老化期，隨后死亡[6]。近年來，細(xì)胞衰老的端粒假說得到越來越多的研究結(jié)果所支持，也獲得越來越多的科學(xué)家的認(rèn)可和肯定。許多研究表明體外培養(yǎng)細(xì)胞的老化加速與細(xì)胞染色體末端的端粒隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐步縮短有關(guān)。例如有證據(jù)表明全世界第一只克隆羊多莉的過早衰老和它的細(xì)胞中染色體端粒比正常的同齡山羊的端粒短20%有關(guān)，所以有人稱多莉是“披著小羊皮的老羊”[7]。Shiels PG等研究[8]表明，生殖細(xì)胞之所以具有較強(qiáng)的有絲分裂能力，在于其端粒酶活性處于高活性狀態(tài)，其端粒長度長期維持在一個(gè)恒定的高水平；各種干細(xì)胞和嬰幼兒的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，和某些動(dòng)物細(xì)胞（例如兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞）之所以保持潛在的有絲分裂能力，在于其端粒酶處于弱活性狀態(tài)；而絕大多數(shù)人類體細(xì)胞的端粒酶處于失活狀態(tài)，無法進(jìn)行有絲分裂，損傷后無法增殖再生，例如成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞就是如此。目前眼科界普遍認(rèn)為，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有相同的增殖特性，失去了有絲分裂能力。由于正常成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞不容易獲取，影響因素較多，實(shí)驗(yàn)條件不容易掌控，而貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞容易獲取，體外培養(yǎng)條件成熟，實(shí)驗(yàn)容易掌控，所以本次研究動(dòng)物模型選用貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，間接探討端粒酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。端粒酶是由三個(gè)部分構(gòu)成的，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），端粒酶RNA模板（TR）和端粒酶相關(guān)蛋白[9]。由于目前對(duì)TERT研究得較為清楚，它是端粒酶蛋白的催化亞單位，有相關(guān)研究領(lǐng)域成功經(jīng)驗(yàn)可以借鑒，實(shí)驗(yàn)試劑購買比較容易，所以本次研究選用TERT作為轉(zhuǎn)染基因，通過將兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染至端粒酶失活細(xì)胞——貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞中，以期恢復(fù)或部分恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力，構(gòu)建“永生化”的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，為角膜組織工程提供種子細(xì)胞，并為進(jìn)一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
3.2 端粒酶基因轉(zhuǎn)染與角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長
本研究結(jié)果顯示，貓角膜內(nèi)皮-TERT細(xì)胞中TERT蛋白表達(dá)明顯高于貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，表明rTERT已成功轉(zhuǎn)染至貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并且開始有rTERT蛋白的表達(dá)。貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染后，TERT蛋白表達(dá)量和Ⅳ型膠原表達(dá)量比正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP增加，說明外源性端粒酶基因轉(zhuǎn)入后，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)功能正常，端粒酶失活抑制狀態(tài)可能得到了某種程度上的解除，預(yù)示端粒酶活性在體外培養(yǎng)條件下可以在一定程度上進(jìn)行掌控，適合于基因工程研究對(duì)目的基因的要求。Ⅳ型膠原是角膜后彈力層的主要成分，主要由角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌，有利于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和維持其固有的六邊形結(jié)構(gòu)，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)，有利于其伸展和粘附，縮短損傷后的修復(fù)時(shí)間，改善修復(fù)質(zhì)量，為防止角膜失代償?shù)於ɑA(chǔ)。本研究細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染兔端粒酶基因后，貓角膜內(nèi)皮S期和G2~M期細(xì)胞比例明顯增高，而G0~G1期細(xì)胞比例明顯下降，和正常對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其是S期細(xì)胞比例，相對(duì)于表皮生長因子組細(xì)胞也具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)染兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶相對(duì)于表皮生長因子來說，可以促使更多的細(xì)胞進(jìn)入S期，具有更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的能力，可以延長貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生命周期，傳代數(shù)增多，延長貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的壽命，阻斷角膜內(nèi)皮失代償?shù)陌l(fā)病機(jī)制，防治角膜內(nèi)皮失代償。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也說明轉(zhuǎn)染組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外相同培養(yǎng)條件下具有良好的增殖能力，數(shù)量明顯比正常對(duì)照組和表皮生長因子組增多，細(xì)胞貼壁能力增強(qiáng)，易于形成偽足，具有應(yīng)有的形變能力和伸展粘附能力。而且隨著傳代數(shù)的增多，觀察至30代后表型結(jié)構(gòu)正常，倒置相差顯微鏡下未發(fā)生明顯突變征象，表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)可以使貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞建立“永生化”細(xì)胞系，和端粒酶基因轉(zhuǎn)染胰島素分泌細(xì)胞研究結(jié)果類似[10]，符合角膜組織工程對(duì)種子細(xì)胞的要求，具有良好的組織工程應(yīng)用前景?？傊?，流式細(xì)胞儀和分子生物學(xué)檢測以及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后一定觀察期內(nèi)，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，并且具有較強(qiáng)的增殖、蛋白表達(dá)、分泌和粘附功能。基因轉(zhuǎn)染具有雙重性，端粒酶基因轉(zhuǎn)染也不另外，掌控不合理或失去掌控可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞無限增殖，至于兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶后會(huì)不會(huì)誘發(fā)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞無限增殖，本研究由于缺乏細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察和遠(yuǎn)期觀察，目前無法定論，有待進(jìn)一步探討。
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TELOMERASE GENE TRANSFECTION ON THE PREVENTION OF CORNEAL ENDOTHELIAL DECOMPENSATION
ZHANG Yu-yan1,2
（1.School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, jiangxi 343009, China; 2. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000,China）
: To evaluate the effects of telomerase transfection on the morphology and function of corneal endothelial cells.：Cat corneal endothelial cells cultured in vitro were divided into 3 groups randomly, as rabbit telomerase transfection group, normal control group and epidermal growth factor group. After cultured for 30 generations, cell morphology and cell ratio changes each phase in the cycle were observed, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV was detected.：Rabbit telomerase transfection group had more cells than that in the normal control group and epidermal growth factor group, stretching adherent ability of the cells with normal phenotype was enhanced, cell ratio in M phase and S phase of G2 increased significantly, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV also increased than that of the normal control group.：Rabbit telomerase transfection can promote the proliferation of cat corneal endothelial cell with normal phenotype, can strengthen the stretching adhesion ability and secretion function, it is in favor of the treatment of corneal endothelial decompensation.
telomerase; gene transfection; corneal endothelial cell; proliferation
R772.2
A
10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021
1674-8085(2012)02-0084-04
2011-12-18；
2012-02-17
張愈延(1958-)，男，江西萬安人，教授、主任醫(yī)師，主要從事角膜病、青光眼、眼表疾病等研究(E-mail: zyy8830669@sohu.com).
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張愈延
端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/p>
張愈延1,2
（1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000）
評(píng)價(jià)端粒酶轉(zhuǎn)染對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響。將體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組，兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組和表皮生長因子組。培養(yǎng)30代后觀察傳代細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例的變化，檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)。兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組和表皮生長因子組增多，伸展貼壁能力增強(qiáng)，表型正常，G2~M期和S期細(xì)胞比例顯著增加，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)也較正常對(duì)照組增多。兔端粒酶轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖且表型正常，可以增強(qiáng)其伸展粘附能力和分泌功能，有利于防治角膜內(nèi)皮失代償。
端粒酶；基因轉(zhuǎn)染；角膜內(nèi)皮細(xì)胞；增殖
角膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常是維持角膜透明性的重要前提。在嬰幼兒，角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以進(jìn)行有絲分裂，但在成年后不再進(jìn)行有絲分裂。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其缺損區(qū)由鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞增大、擴(kuò)展和移行滑動(dòng)來填補(bǔ)覆蓋。所以，隨著年齡的增長，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度逐漸下降。當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度由于各種病損的作用低于某一臨界值時(shí)，發(fā)生角膜水腫和大泡性角膜病變，稱為角膜內(nèi)皮失代償。如何恢復(fù)成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力以及防治角膜內(nèi)皮失代償一直是眼科界的研究熱點(diǎn)。本研究依據(jù)細(xì)胞衰老的端粒假說，用兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討其?duì)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，以期恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力，為進(jìn)一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 pIRES2-增強(qiáng)性綠色熒光蛋白（EGFP）-rTERT正義熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
仿照文獻(xiàn)[1]所采用pIRES2-EGFP-人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）正義熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法和步驟操作，采用NotⅠ酶切法進(jìn)行連接方向性的鑒定。
1.2 貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)
取健康家貓新鮮眼球數(shù)只，用無菌PBS溶液沖洗干凈后，抗生素D-Hanks液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)浸泡30 min，按照參考文獻(xiàn)[2]所采用的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約100×106·L-1，每孔200 μL接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板每6孔為1組，分為3組，分別命名為端粒酶基因轉(zhuǎn)染組（A組）、正常對(duì)照組（B組）和表皮生長因子組（C組）；A組擬進(jìn)一步轉(zhuǎn)染rTERT，B組不作任何處理，C組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入表皮生長因子，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行飽和濕度培養(yǎng)。原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)36 h后換液1次。以后每2 d換液1次，備用。
1.3 rTERT導(dǎo)入原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞
采用Lipofectin試劑盒，通過脂質(zhì)體法，按照試劑盒操作說明和文獻(xiàn)[3]所采用的hTERT轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人類胚胎成纖維細(xì)胞的操作方法，在實(shí)驗(yàn)室條件下將rTERT轉(zhuǎn)染導(dǎo)入A組原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞中，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)。
1.4 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測
將轉(zhuǎn)染rTERT貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞（A組）繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，按照參考文獻(xiàn)[4]所介紹的方法處理后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞生長周期。同期、同條件下培養(yǎng)的B組和C組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞也按照相同操作方法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞生長周期。
1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
將培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細(xì)胞分別放在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化。
1.6 貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)
采用蛋白印跡法，對(duì)培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[5]所述的詳細(xì)步驟操作，進(jìn)行貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)量的檢測。當(dāng)正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT及貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP達(dá)90 %融合時(shí)，再參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行操作，擴(kuò)增后分別命名為貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞形態(tài)變化
倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，A組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，易于聚集成群，貼壁范圍較廣，細(xì)胞較大呈不規(guī)則形狀，部分呈六邊形，周邊細(xì)胞可見伸出偽足；B組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞較小，貼壁細(xì)胞較少，多呈圓形或橢圓形團(tuán)狀；C組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞也見增多，但細(xì)胞多呈懸浮狀態(tài)，貼壁較少，偽足不明顯。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，A組、C組細(xì)胞數(shù)量較B組增多更為明顯。
2.2 細(xì)胞生長周期變化
經(jīng)單因素方差分析，與B組相比，A組、C組G0~G1期(G0：靜止期；G1：DNA合成準(zhǔn)備期)細(xì)胞比例顯著下降（< 0.05），三組間兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）；與B組相比，A組、C組G2~M期(G2：DNA合成后期；M期：有絲分裂期)細(xì)胞比例顯著提高(< 0.05)，但A組和C組G2~M期細(xì)胞比例的變化(> 0.05)在α = 0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組相比，A組、C組S期(S期：DNA合成期) 細(xì)胞比例顯著提高(< 0.05)，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。
表1 兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染和表皮生長因子應(yīng)用對(duì)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例的影響
a> 0.05，A組、C組比較（單因素方差分析, SNK-檢驗(yàn)）
2.3 TERT蛋白和Ⅳ型膠原表達(dá)量的變化
蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-rTERT、貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP中均有TERT蛋白表達(dá)，但貓角膜內(nèi)皮-rTERT細(xì)胞中TERT蛋白表達(dá)量明顯高于貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并且開始有兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達(dá)。另外，貓角膜內(nèi)皮-rTERT細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)量較正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞及貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP也顯著增加。
3 討論
3.1 端粒酶結(jié)構(gòu)與貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的研究
端粒酶是一種特殊的核糖核酸蛋白質(zhì)聚合物，是依賴RNA的DNA聚合酶。Gryfe R等于1997年提出了細(xì)胞衰老的端粒假說，即細(xì)胞衰老和永生假說，這種假說認(rèn)為細(xì)胞衰老是端粒復(fù)制問題得不到補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果，端粒的縮短是正常體細(xì)胞老化的有絲分裂鐘，當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，即所謂的末端限制片段（TRF）的長度為5~7 kb時(shí)，就有信號(hào)指令細(xì)胞退出細(xì)胞周期，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細(xì)胞周期的G1期和G2PM期之間的某個(gè)時(shí)期，這時(shí)的細(xì)胞便進(jìn)入了老化期，隨后死亡[6]。近年來，細(xì)胞衰老的端粒假說得到越來越多的研究結(jié)果所支持，也獲得越來越多的科學(xué)家的認(rèn)可和肯定。許多研究表明體外培養(yǎng)細(xì)胞的老化加速與細(xì)胞染色體末端的端粒隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐步縮短有關(guān)。例如有證據(jù)表明全世界第一只克隆羊多莉的過早衰老和它的細(xì)胞中染色體端粒比正常的同齡山羊的端粒短20%有關(guān)，所以有人稱多莉是“披著小羊皮的老羊”[7]。Shiels PG等研究[8]表明，生殖細(xì)胞之所以具有較強(qiáng)的有絲分裂能力，在于其端粒酶活性處于高活性狀態(tài)，其端粒長度長期維持在一個(gè)恒定的高水平；各種干細(xì)胞和嬰幼兒的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，和某些動(dòng)物細(xì)胞（例如兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞）之所以保持潛在的有絲分裂能力，在于其端粒酶處于弱活性狀態(tài)；而絕大多數(shù)人類體細(xì)胞的端粒酶處于失活狀態(tài)，無法進(jìn)行有絲分裂，損傷后無法增殖再生，例如成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞就是如此。目前眼科界普遍認(rèn)為，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有相同的增殖特性，失去了有絲分裂能力。由于正常成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞不容易獲取，影響因素較多，實(shí)驗(yàn)條件不容易掌控，而貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞容易獲取，體外培養(yǎng)條件成熟，實(shí)驗(yàn)容易掌控，所以本次研究動(dòng)物模型選用貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，間接探討端粒酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。端粒酶是由三個(gè)部分構(gòu)成的，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），端粒酶RNA模板（TR）和端粒酶相關(guān)蛋白[9]。由于目前對(duì)TERT研究得較為清楚，它是端粒酶蛋白的催化亞單位，有相關(guān)研究領(lǐng)域成功經(jīng)驗(yàn)可以借鑒，實(shí)驗(yàn)試劑購買比較容易，所以本次研究選用TERT作為轉(zhuǎn)染基因，通過將兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染至端粒酶失活細(xì)胞——貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞中，以期恢復(fù)或部分恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂能力，構(gòu)建“永生化”的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，為角膜組織工程提供種子細(xì)胞，并為進(jìn)一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
3.2 端粒酶基因轉(zhuǎn)染與角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長
本研究結(jié)果顯示，貓角膜內(nèi)皮-TERT細(xì)胞中TERT蛋白表達(dá)明顯高于貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，表明rTERT已成功轉(zhuǎn)染至貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并且開始有rTERT蛋白的表達(dá)。貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染后，TERT蛋白表達(dá)量和Ⅳ型膠原表達(dá)量比正常貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞和貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞-EGFP增加，說明外源性端粒酶基因轉(zhuǎn)入后，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)功能正常，端粒酶失活抑制狀態(tài)可能得到了某種程度上的解除，預(yù)示端粒酶活性在體外培養(yǎng)條件下可以在一定程度上進(jìn)行掌控，適合于基因工程研究對(duì)目的基因的要求。Ⅳ型膠原是角膜后彈力層的主要成分，主要由角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌，有利于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和維持其固有的六邊形結(jié)構(gòu)，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)，有利于其伸展和粘附，縮短損傷后的修復(fù)時(shí)間，改善修復(fù)質(zhì)量，為防止角膜失代償?shù)於ɑA(chǔ)。本研究細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染兔端粒酶基因后，貓角膜內(nèi)皮S期和G2~M期細(xì)胞比例明顯增高，而G0~G1期細(xì)胞比例明顯下降，和正常對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其是S期細(xì)胞比例，相對(duì)于表皮生長因子組細(xì)胞也具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)染兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶相對(duì)于表皮生長因子來說，可以促使更多的細(xì)胞進(jìn)入S期，具有更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的能力，可以延長貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生命周期，傳代數(shù)增多，延長貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的壽命，阻斷角膜內(nèi)皮失代償?shù)陌l(fā)病機(jī)制，防治角膜內(nèi)皮失代償。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也說明轉(zhuǎn)染組貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外相同培養(yǎng)條件下具有良好的增殖能力，數(shù)量明顯比正常對(duì)照組和表皮生長因子組增多，細(xì)胞貼壁能力增強(qiáng)，易于形成偽足，具有應(yīng)有的形變能力和伸展粘附能力。而且隨著傳代數(shù)的增多，觀察至30代后表型結(jié)構(gòu)正常，倒置相差顯微鏡下未發(fā)生明顯突變征象，表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)可以使貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞建立“永生化”細(xì)胞系，和端粒酶基因轉(zhuǎn)染胰島素分泌細(xì)胞研究結(jié)果類似[10]，符合角膜組織工程對(duì)種子細(xì)胞的要求，具有良好的組織工程應(yīng)用前景?？傊?，流式細(xì)胞儀和分子生物學(xué)檢測以及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后一定觀察期內(nèi)，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，并且具有較強(qiáng)的增殖、蛋白表達(dá)、分泌和粘附功能。基因轉(zhuǎn)染具有雙重性，端粒酶基因轉(zhuǎn)染也不另外，掌控不合理或失去掌控可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞無限增殖，至于兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶后會(huì)不會(huì)誘發(fā)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞無限增殖，本研究由于缺乏細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察和遠(yuǎn)期觀察，目前無法定論，有待進(jìn)一步探討。
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TELOMERASE GENE TRANSFECTION ON THE PREVENTION OF CORNEAL ENDOTHELIAL DECOMPENSATION
ZHANG Yu-yan1,2
（1.School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, jiangxi 343009, China; 2. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000,China）
: To evaluate the effects of telomerase transfection on the morphology and function of corneal endothelial cells.：Cat corneal endothelial cells cultured in vitro were divided into 3 groups randomly, as rabbit telomerase transfection group, normal control group and epidermal growth factor group. After cultured for 30 generations, cell morphology and cell ratio changes each phase in the cycle were observed, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV was detected.：Rabbit telomerase transfection group had more cells than that in the normal control group and epidermal growth factor group, stretching adherent ability of the cells with normal phenotype was enhanced, cell ratio in M phase and S phase of G2 increased significantly, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV also increased than that of the normal control group.：Rabbit telomerase transfection can promote the proliferation of cat corneal endothelial cell with normal phenotype, can strengthen the stretching adhesion ability and secretion function, it is in favor of the treatment of corneal endothelial decompensation.
telomerase; gene transfection; corneal endothelial cell; proliferation
R772.2
A
10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021
1674-8085(2012)02-0084-04
2011-12-18；
2012-02-17
張愈延(1958-)，男，江西萬安人，教授、主任醫(yī)師，主要從事角膜病、青光眼、眼表疾病等研究(E-mail: zyy8830669@sohu.com).
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