張 旭 曹譯心 張翠薇 伍 洋

1（瀘州醫(yī)學(xué)院 病理教研室，瀘州646000）

2（瀘州醫(yī)學(xué)院 組胚教研室，瀘州646000）

3（瀘州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 急診科，瀘州646000）

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，包括外界環(huán)境，自身因素，抑癌基因或癌基因的缺失、突變、激活及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常改變等。p53 是重要的抑癌基因，p53 基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后有關(guān)，p53 定位于染色體17p13.1，因此17號(hào)染色體的改變也受到越來(lái)越多的重視。本研究采用熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體的改變，并對(duì)其17號(hào)染色體位點(diǎn)存在的P53蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，希望能夠找出二者之間的相關(guān)性，并為大腸癌的預(yù)后提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年大腸癌標(biāo)本67例，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理診斷為大腸癌，均為腺癌。其中男性37例，女性30例，中位年齡55歲，其它病理參數(shù)見(jiàn)表1。所有病例均為石蠟包埋，4 μm 厚切片。

1.2 FISH 檢測(cè)

17號(hào)（Spectrum red）染色體著絲粒探針，購(gòu)自美國(guó)Vysis公司。4μm 厚石蠟切片一張用于17號(hào)染色體FISH 分析。實(shí)驗(yàn)步驟如下：常規(guī)脫蠟水化，置于梯度酒精脫水，50℃水浴下30%酸性亞硫酸鈉預(yù)處理30分鐘，2×SSC（氯化鈉、檸檬酸鈉緩沖液）洗滌2 次，37 ℃蛋白酶K 消化10 分鐘，依次經(jīng)70%、85%、100%酒精各脫水2分鐘，自然干燥。取10μl探針混合液滴于玻片，加蓋玻片，橡膠水泥封片，放入原位雜交儀，37 ℃過(guò)夜，雜交后2×SSC 洗滌，暗處自然干燥，滴加二咪基苯基吲哚（DAPI）顯色液，蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用EnVision法，p53單克隆抗體及EnVision試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

FISH 檢測(cè)結(jié)果判定：低倍選定腫瘤區(qū)域，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色信號(hào)即為17號(hào)染色體倍體情況，細(xì)胞核內(nèi)紅色信號(hào)≥3個(gè)視為多倍體，＜2個(gè)信號(hào)視為單倍體。

免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：p53以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17號(hào)染色體異倍體和P53蛋白在腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

癌組織中17號(hào)染色體異倍體31例，其中多倍體29例，單倍體2例（見(jiàn)圖1A，B），以多倍體為主。17號(hào)染色體異倍體與患者年齡、性別，腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（P＞0.05），只與Dukes分期有關(guān)（P＜0.05），17號(hào)染色體異倍體在高中低分化癌中的發(fā)生率分別為62.5%（10／16），42.9%（12／28），39.1%（9／23）（見(jiàn)表1）。

p53在67例癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為55.2%（37／67，見(jiàn)圖2A，B），與臨床病理參數(shù)比較，其陽(yáng)性表達(dá)與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與其他臨床各參數(shù)之間比較顯著性差別（P＞0.05），p53在高中低分化癌中的陽(yáng)性率分別為56.3%（9／16），60.7%（17／28），47.8%（11／23）（見(jiàn)表1）。

表1 17號(hào)染色體異倍體與P53蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 Chromosome 17aneuploidy and P53protein expression with clinicopathological parameters

2.2 大腸癌中17號(hào)染色體異倍體與p53蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性

17號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)有31例異倍體，其中有14例與p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)相同，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，二者之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＝0.124）（見(jiàn)表2）。

表2 17號(hào)染色體多倍體與P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation of chromosomes 17and P53protein expression

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展歸根到底是遺傳學(xué)的變化，其中主要是遺傳物質(zhì)的改變，包括染色體數(shù)目結(jié)構(gòu)的異常，染色體的數(shù)目異常表現(xiàn)多樣，常見(jiàn)有單倍體，三倍體，四倍體及以上等異倍體現(xiàn)象。檢測(cè)這些染色體的異常多數(shù)集中于惡性腫瘤，在大腸癌中，同樣存在染色體數(shù)目的異常情況，本研究采用FISH 技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒在大腸癌中的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17號(hào)染色體在67例大腸癌中有31例發(fā)生異倍體，其中多倍體29例，單倍體2例，因此可知大腸癌中17 號(hào)染色體異常多數(shù)是多倍體狀態(tài)。有學(xué)者［1］對(duì)胃癌中的17號(hào)染色體的改變進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌中同樣存在17號(hào)染色體多倍體增多的現(xiàn)象，99例中有56例為多倍體，2例為單倍體，與本研究結(jié)果基本相似。

早期已有報(bào)道［2］，17號(hào)染色體斷臂丟失是晚期大腸癌的標(biāo)記，是患者預(yù)后不良的指標(biāo)。本研究檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒的改變，17號(hào)染色體改變與臨床病理參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，與患者的年齡、性別及腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，而與Dukes分期有關(guān)，我們?cè)诒容^過(guò)程中，反復(fù)比對(duì)，結(jié)果仍然一致，我們分析認(rèn)為，在大腸癌中，17號(hào)染色體異倍體貫穿于癌的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程中，可能與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)。本結(jié)論與早期研究結(jié)果不一致，是否與研究例數(shù)有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在膀胱癌中研究發(fā)現(xiàn)，隨著分級(jí)的升高，17號(hào)染色體多倍體改變顯著增加，17 號(hào)染色體畸變與膀胱癌的分級(jí)呈正相關(guān)［3，4］。但本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示大腸癌中17號(hào)染色體改變與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)，因此我們認(rèn)為在大腸癌中17號(hào)染色體的改變只與大腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)而與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)。雖然未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是可以看出，17號(hào)染色體異倍體在高中低分化癌中的發(fā)生率依次降低，17號(hào)染色體在分化高的腫瘤中發(fā)生異倍體的頻率較高，這可能提示17號(hào)染色體異倍體與腫瘤的早期發(fā)生有關(guān)。

眾所周知，p53是重要的抑癌基因，在多種腫瘤中均表達(dá)增高，p53發(fā)生基因突變后，失去了控制細(xì)胞生長(zhǎng)及DNA 修復(fù)的作用，使染色體異常改變隨著傳代不斷遺傳，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變，形成腫瘤［5］。本研究發(fā)現(xiàn)p53在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為55.2%，稍高于單寶珍等［6］研究結(jié)果（48.5%），而低于趙光明等［7］研究結(jié)果（66.7%）。我們還發(fā)現(xiàn)，p53表達(dá)與患者年齡、性別及分化程度無(wú)關(guān)，但有文獻(xiàn)報(bào)道［8，9］，30例大腸癌中，p53表達(dá)與分化程度有關(guān)，這可能與研究例數(shù)有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)顯示p53表達(dá)只與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著Dukes分期的增加，p53陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)增加，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例陽(yáng)性例數(shù)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例，表明p53陽(yáng)性表達(dá)可能與患者的預(yù)后相關(guān)，是患者預(yù)后差的標(biāo)記，這與眭怡群等［5］研究結(jié)果一致，因此我們提示未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的35例中8例陽(yáng)性的患者應(yīng)該引起注意，加強(qiáng)隨訪(fǎng)。

p53是位于17號(hào)染色體短臂上的基因，突變型p53的表達(dá)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因［10］，因此17號(hào)染色體的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，王權(quán)等［11］人應(yīng)用微衛(wèi)星雜合性缺失的方法發(fā)現(xiàn)胃癌中17號(hào)染色體可能存在3個(gè)與胃癌相關(guān)的基因，而p53可能是其中之一，但該研究還需要其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本研究采用FISH 方法檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其異倍體的發(fā)生率與p53陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)關(guān)，該結(jié)果雖然與在乳腺癌中的研究結(jié)果［12］相似，但是我們分析認(rèn)為由于p53 是位于17號(hào)染色體上的基因，那么二者之間一定有某種聯(lián)系，這可能與研究方法和例數(shù)有關(guān)，也可能是17號(hào)染色體還存在其他的與p53相似的基因但尚未發(fā)現(xiàn)。

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