蘇有明，李海濤，祝 賀，任冬梅，宋克敏，楊蓉婭

局限性硬皮病的病因至今尚未完全明了，有研究認為與機體免疫功能相關[1-4]。為探討炎癥免疫相關細胞因子在限局性硬皮病中的意義，我們對39例局限性硬皮病患者外周血T淋巴細胞及血清可溶性白介素2α受體（sIL-2R）和腫瘤壞死因子（TNF）-α進行檢測，以探討其在發(fā)病中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究資料

39例局限性硬皮病患者為我院皮膚科門診及住院患者，均符合局限性硬皮病診斷標準，并經(jīng)組織病理檢查確診。其中斑塊狀硬皮病16例，點滴狀硬皮病7例，線狀或帶狀硬皮病13例，泛發(fā)性硬皮病3例。男27例，女12例，年齡6～45歲。依據(jù)臨床表現(xiàn)分為活動期21例、非活動期18例（活動期硬皮?。浩p逐漸擴大，反復出現(xiàn)新皮損，有紫紅色斑，逐漸變硬，表面光滑發(fā)亮，毛細血管擴張；非活動期硬皮?。翰〕蹋?年，沒有新皮損出現(xiàn)，舊皮損大小無改變，皮損變軟呈棕色）。對照組為39名健康獻血者，男24例，女15例，年齡26～48歲。所有入組者檢測前均未使用過糖皮質激素和免疫調節(jié)劑。限局性硬皮病組和對照組均無菌抽取靜脈血2 ml，分別合并并分離血清，于-30℃儲存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r實驗當場分別取兩組入組者靜脈血4 ml。

1.2 器材與試劑

DMEM培 養(yǎng) 基（美 國 SER-VA）、PHA（美 國Sigma公司）、淋巴細胞分液Ficoli（上海試劑廠）；T細胞亞群、TNF-α測定試劑盒（軍事醫(yī)學科學院）；血清sIL-2R測定藥盒（吉林大學醫(yī)學部）。

1.3 實驗方法

1.3.1 T淋巴細胞增殖測定 對照組和局限性硬皮病患者靜脈血4 ml，經(jīng)肝素抗凝，加入1∶50、1∶250、1∶1 250、1∶2 500、1∶5 000 倍量淋巴細胞分離液，離心，獲取外周血淋巴細胞（PBMC），經(jīng)Hanks液洗滌3次，用DMEM培養(yǎng)基將PBMC濃度調整為5×1012個/L的細胞懸液。將24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入PBMC 0.1 ml、DMEM 1 ml、PHA 50 μg、硬皮病患者血清0.1 ml；上述培養(yǎng)體系中將硬皮病患者血清改為對照1組血清0.1 ml，重復上述步驟操作 ；空白對照以DMEM補充至容量。置于5.0%二氧化碳培養(yǎng)箱、37℃培養(yǎng)72 h。離心涂片，瑞氏染色，鏡檢200個細胞，按下列公式計算淋巴細胞增殖率 ：淋巴增殖率（%）=（患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）/（非患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）×100%

1.3.2 血清sIL-2R、TGF-α的測定 采用單克隆與多克隆雙抗體夾心法，按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 局限性硬皮病患者血清對淋巴細胞增殖的影響

無論是局限性硬皮病組或健康對照組的PBMC，加入局限性硬皮病患者血清標本后，淋巴細胞增殖率明顯低于加入正常對照組血清的標本和空白對照組，組間和組內比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1）。

表1 不同來源血清對淋巴細胞增殖率的影響 （±SD，%）

表1 不同來源血清對淋巴細胞增殖率的影響 （±SD，%）

淋巴細胞來源例數(shù)空白對照正常對照血清患者血清患者組 39 41.37±4.89 37.15±2.58 26.56±3.83對照組 39 68.27±3.36 66.89±3.84 42.38±4.44

表2 不同稀釋度患者血清對淋巴細胞增殖率的影響 （±SD，%）

表2 不同稀釋度患者血清對淋巴細胞增殖率的影響 （±SD，%）

細胞來源 例數(shù) 1∶50 1∶250 1∶1 250 1∶2 500 1∶5 000 未加血清患者組 39 25.61±2.44 29.01±2.33 30.84±3.32 34.07±3.91 37.91±2.25 42.93±4.68對照組 39 35.50±4.05 39.80±4.50 40.09±8.64 48.36±2.65 55.78±4.88 68.24±3.89

2.2 不同稀釋度局限性硬皮病患者血清對淋巴細胞增殖的影響

不同稀釋度的局限性硬皮病患者血清對局限性硬皮病患者和對照組的淋巴細胞增殖均有抑制作用（P＜0.05）（表2），且呈劑量依賴關系，濃度越高，抑制效應越強。

2.3 局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α的變化

39例局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α水平明顯高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中局限性硬皮病活動期患者的sIL-2R水平明顯高于正常對照組和非活動期的患者（P＜0.01）。

表3 局限性硬皮病患者與對照組TNF-α、sIL-2R水平比較 （ ±SD）

表3 局限性硬皮病患者與對照組TNF-α、sIL-2R水平比較 （ ±SD）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與非活動期比較，**P＜0.05

組別 例數(shù) sIL-2R TNF-α(U/ml)限局性硬皮病 39 532.4±175.8 2.082 0±0.157 6*活動期 21 675.1±230.1**非活動期 18 380.5±134.3對照組 39 188.6±45.2 1.108 2±0.025 3

3 討論

局限性硬皮病患者血清中出現(xiàn)的免疫抑制因子是導致機體免疫功能紊亂及受抑制的主要原因，免疫抑制因子是一類調節(jié)免疫反應的重要細胞因子，主要來源于T淋巴細胞、巨噬細胞[5]，其中CD4(輔助性T細胞)和CD8(抑制T細胞)對機體的細胞免疫和體液免疫發(fā)揮重要的調節(jié)作用。本研究結果顯示血清中sIL-2R、TNF-α含量較對照組高，提示本病與免疫功能紊亂有關。

局限性硬皮病患者血清對正常人淋巴細胞PHA誘導的增殖活性有顯著抑制作用，此抑制活性呈明顯劑量依賴關系，即使血清稀釋至1∶5 000倍仍具抑制效應，而未加患者血清的淋巴細胞增殖率，則不具有上述規(guī)律。由于本實驗采用局限性硬皮病患者混合血清，可以稀釋為局限性硬皮病淋巴細胞在體外脫離了血清后淋巴細胞增殖率有一定恢復，而加入局限性硬皮病患者血清后，對局限性硬皮病患者淋巴細胞的抑制作用重新表現(xiàn)出來。由此表明局限性硬皮病患者血清中的相關因子在機體免疫抑制中起著重要作用。

sIL-2R是一種T淋巴細胞的激活標志[4,5]，也可反映某一組織或體液免疫活性狀態(tài)。sIL-2R增高一方面可能競爭性的抑制IL-2使之清除加速，從而抑制T淋巴細胞的增殖反應。同時高水平的sIL-2R還可影響B(tài)淋巴細胞功能和體液免疫水平，參與免疫損傷的發(fā)生，激活并促進細胞C-myc、C-fos基因表達，使細胞增殖，加重局限性硬皮病的過程。TNF-α是參與機體損傷時的重要遞質，由巨噬細胞、T淋巴細胞等多種細胞產生[6,7]，除參與免疫和炎癥反應外，同時能夠抑制IL-2依賴性的CD4和CD8 T淋巴細胞的分化。因此，免疫活性細胞、細胞因子和調節(jié)基因的相互作用構成了體內細胞生長和分化的復雜免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)。血清sIL-2R、TNF-α水平升高和T淋巴細胞亞群異常導致了機體免疫功能紊亂，可能是局限性硬皮病的發(fā)病誘因之一[8-10]。細胞因子共同作用于局限性硬皮病皮損中，刺激其增殖、增強其活性，使其合成并分泌大量的膠原和纖連蛋白，引起ECM的合成和沉積增加，參與局限性硬皮病纖維化形成過程。

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