謝 琦 ，張鼎旋 ，梁碧玲 ，陳明旺 ，張 靜 ，吳延恒

（1.廣州醫(yī)學院附屬廣州市第一人民醫(yī)院/廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學影像科，廣東 廣州 510240；2.中山大學第二附屬醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510120；3.廣州醫(yī)學院附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；4.暨南大學第一臨床醫(yī)學院影像科，廣東 廣州 510635）

rAd/p53治療效果的活體評價目前局限于用影像方法觀察腫瘤大小的改變[1-3]。而rAd/p53治療的有效性最早體現(xiàn)在p53能進入腫瘤細胞內(nèi)并成功轉(zhuǎn)錄、表達、引起腫瘤內(nèi)部細胞凋亡、壞死[1-2]，而腫瘤大小改變出現(xiàn)較晚。MR擴散加權(quán)成像（DWI）在判斷腫瘤細胞的生物學特性與壞死方面具有很大潛力[4-8]，本研究擬運用磁共振DWI觀察rAd/p53治療結(jié)腸癌荷瘤鼠的早期改變，探索DWI活體無創(chuàng)評價rAd/p53早期抗癌療效的標記物。

1 材料和方法

1.1 動物模型制作

BALB/c裸鼠購自中山大學動物實驗部，19～23 g體質(zhì)量，鼠齡4～6周，雌雄不限，養(yǎng)殖于中山大學動物實驗部SPF級實驗室。人類結(jié)腸癌SW480細胞株（p53突變型）購自中國科學院上海細胞庫。常規(guī)細胞培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞制成濃度為1×107mL-1的細胞懸液。

將上述SW480細胞懸液分別注射至5只裸鼠脅部皮下（0.5mL/只）。15d后腫瘤生長至1.5～1.8cm，小鼠在麻醉狀態(tài)下（4.5%水合氯醛2 mL/100 g腹腔注射）切取腫瘤塊并切成約2 mm3小塊作為移植瘤材，并種植于52只外表健康裸鼠皮下。

上述荷瘤鼠于種瘤后42 d，活體測量腫瘤大小并計算腫瘤體積（V=π/6×長×寬×高）[9]，按腫瘤大小隨機均勻分成2組：對照組，給予生理鹽水；rAd/p53（深圳賽百諾生物科技公司）治療組，1×107VIP的rAd/p53/mm3腫瘤，每組25只。給藥途徑為直接瘤內(nèi)注射。

1.2 療效檢測

1.2.1 MR檢查

上述荷瘤鼠治療后分籠飼養(yǎng)，于假治療或治療后 24 h、48 h、72 h、120 h、168 h 各組分別隨機取 5個腫瘤量荷瘤鼠，同上方法麻醉荷瘤鼠，用Philips Gyroscan Intera Achieva 1.5T Ivova Dual HP超導型MR成像儀、膝關(guān)節(jié)8通道相控陣線圈（Synkeen-8）行以下序列成像。

T2WI快速自旋回波（TSE）：TR/TE=2600ms/100ms，SENSE加速因子=2，行軸位、冠狀、矢狀位成像，成像時間=65 s。采集矩陣=172×135，重建矩陣=224×224，層厚=2 mm，間隔=0，F(xiàn)OV=120 mm。

DWI[9]：采用單次激發(fā)平面回波成像序列（EPI），橫軸位成像，TR=639～1 220 ms，TE＝43～49 ms， 隨 b值相應調(diào)整，按各向同性施加擴散敏感梯度場，b=800 s/mm2， 采集時間 28.5 s，F(xiàn)OV=120 mm，NAS=6，層厚 2 mm，間隔=0，采集矩陣＝64×62，重建矩陣＝96×96。

1.2.2 標本的實驗檢測

荷瘤鼠完成上述檢查后，腹腔注射常規(guī)麻醉量5倍的水合氯醛處死，完整取出腫瘤，將腫瘤以成像軸位最大徑線處對半切開，一半即凍于-30°C冰箱用于western blot，另一半用4%BPS緩沖福爾馬林固定液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，TUNNEL法檢測細胞凋亡（細胞凋亡原位檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

2.2 兩組患者出院后發(fā)生不良反應情況 對照組患者出院1個月后大便出血1例，牙齦出血1例;3個月后大便出血2例，皮膚黏膜出血2例，下肢血栓栓塞2例;6個月后大便出血2例，牙齦出血2例，胃出血1例;下肢血栓栓塞2例。實驗組出院6個月后牙齦出血1例。兩組患者出院3、6個月發(fā)生不良反應情況比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

western blot檢測：從-30℃的冰凍組織提取細胞液，抗原抗體免疫反應的一抗為1∶2 000濃度免抗p53抗體（Santa Crag Bictech公司）或鼠抗β-actin抗體（Baster公司），二抗為1∶3 000濃度抗兔IgGHRP或1∶4 000濃度抗鼠IgG-HRP（Cell Signaling technology公司）。

1.3 結(jié)果判定

ADC值與EADC值的測量：DWI采集的數(shù)據(jù)用磁共振成像儀自帶的分析軟件擬合出ADC圖和EADC圖，在腫瘤最大切面利用感興趣區(qū)（ROI）自動測量并計算出ADC值、EADC值。ROI在腫瘤中央?yún)^(qū)域覆蓋高信號區(qū)（ADC圖），或低等信號區(qū)（EADC圖），測量腫瘤中央的ADC值與EADC值；在上述區(qū)域四周各取4個ROI，測量周圍的ADC值和EADC值，取4個值的均值為腫瘤周邊的ADC值與EADC值。ROI面積為8.7～69.5 mm2。

病理切片由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師分別按同一標準在光學顯微鏡下閱片分析，取兩者采集的均數(shù)值為病理檢測結(jié)果。TUNNEL檢測陽性細胞為細胞核呈棕黃色。在100倍視野下觀察并估算切片內(nèi)TUNNEL染色陽性細胞與形態(tài)為死亡細胞的腫瘤細胞面積的百分比為腫瘤凋亡范圍。

western blot p53蛋白表達圖像分析：最終膠體的顯影結(jié)果經(jīng)掃描儀掃入電腦以JPG格式保存，用Imagepro-plus 6.0版自動圖像分析系統(tǒng)處理自動計算每組樣本每個條帶光密度（IOD）。

1.4 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0軟件中建立數(shù)據(jù)庫計算分析，整體樣本檢驗采用秩和檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon檢驗，相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)檢驗，將P<0.05設(shè)為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

rAd/p53治療后24 h即可見腫瘤中央出現(xiàn)ADC圖上的高信號、EADC上為低信號區(qū)域或相應區(qū)域范圍擴大（圖1）。

2.1 腫瘤ADC值與EADC值改變

2.1.1 腫瘤中部

EADC值：rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤中部的EADC值較對照組降低。各時間點W統(tǒng)計量與P值依時間遞增分別為：15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖3）。

2.1.2 腫瘤邊緣

ADC值：rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤邊緣部的ADC值多較對照組增加。各時間點W統(tǒng)計量與P值依時間遞增分別為：10，0.008；27，1.000；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖4）。

EADC值rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤邊緣的EADC值較對照組降低。各時間點W統(tǒng)計量與P值依時間遞增分別為20，0.151；15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖 5）。

2.2 實驗評價

2.2.1 TUNNEL

圖1 單純rAd/p53治療后腫瘤在T2WI、ADC圖、EADC圖的改變。對照組（圖1a），治療后24 h（圖1b）。Figure 1.Tumor on T2WI,ADC and EADC images.Control group(Figure 1a).24 h after rAd/p53 adminstration(Figure 1b).

圖2 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤中部ADC值變化圖。Figure 2. ADC value in the center of tumor after rAd/p53 injection.

圖3 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤中部EADC值變化圖。Figure 3. EADC value in the center of tumor after rAd/p53 injection.

圖4 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤邊緣ADC值變化圖。Figure 4. ADC value at the periphery of tumor after rAd/p53 injection.

圖5 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤邊緣EADC值變化圖。Figure 5. EADC value at the periphery of tumor after rAd/p53 injection.

rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤內(nèi)細胞凋亡較對照組增加，見表1（Wilcoxon 檢驗，P≤0.016）。

2.2.2 p53 表達（western blot）結(jié)果見表2，圖6。

p53蛋白表達：rAd/p53治療24 h可見增加，120 h達峰值；基因+碘油治療，24 h即增加，48 h達峰值，治療后不同時間點，腫瘤p53蛋白表達較對照組增加（Wilcoxon 檢驗，P≤0.016）。

表1 不同配伍治療腫瘤細胞凋亡（TUNNEL）情況的比較（）

表1 不同配伍治療腫瘤細胞凋亡（TUNNEL）情況的比較（）

組別 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h對照組 0.323±0.060 8 0.353±0.033 0 0.347±0.051 2 0.323±0.054 2 0.403±0.053 6 p53 治療組 0.515±0.172 2 0.545±0.055 8 0.531±0.048 2 0.648±0.120 8 0.578±0.073 2

表2 不同配伍治療腫瘤治療組與對照組p53表達光密度情況的比較（）

表2 不同配伍治療腫瘤治療組與對照組p53表達光密度情況的比較（）

組別 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h對照組 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 p53 治療組 404.86±133.86 396.99±159.84 1 262.12±218.95 1 283.35±194.23 991.77±108.17

圖6 rAd/p53與對照組在不同時間點腫瘤細胞p53表達western blot檢測。圖6a分別為對照組，治療 24 h，48 h，72 h，120 h 和 168 h。圖6b 為 β-actin。Figure 6.Western blot analysis of p53 expression of tumor at different time point after rAd/p53 injection.

2.3 不同評價方法的相關(guān)性分析（spearman相關(guān)分析）

p53表達光密度與腫瘤凋亡范圍呈明顯正相關(guān)（γ、P：0.667 8，0.000 0）。ADC 值與腫瘤細胞凋亡范圍呈正相關(guān)（γ、P：0.205 3，0.000 0）， 與腫瘤 p53 表達光密度呈正相關(guān)（γ、P：0.2038，0.0000）。EADC 值與腫瘤細胞凋亡范圍呈負相關(guān)（γ、P：-0.3184，0.0000），與腫瘤 p53表達光密度呈負相關(guān)（γ、P：-0.328 0，0.0000）。

3 討論

p53已作為替換突變與失活的腫瘤抑制基因以達到治療腫瘤目的的經(jīng)典候選基因。在p53治療腫瘤的實驗與臨床研究可見，有效的治療可出現(xiàn)外源性野生型p53蛋白的高表達，促進腫瘤細胞滯于G1期，通過多條生物途徑引起腫瘤細胞凋亡增加[1-2，10-11]。因此，p53蛋白是外源性野生型p53治療腫瘤的早期抗癌效果的分子標志物。本研究結(jié)果也顯示，rAd/p53治療結(jié)腸癌荷瘤裸鼠，腫瘤細胞的凋亡與p53蛋白的表達呈正相關(guān)。

但p53要發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞周期、促進腫瘤凋亡的作用，需要其下游有完整的信號轉(zhuǎn)導通路，凋亡前基因bax等的功能正常并被激活[12]。有研究表明，對帶bax突變的LS174T結(jié)腸癌細胞株在p53過表達的情況下，腫瘤細胞凋亡仍受抑制[13]?？梢姡c其它抗癌藥物一樣，rAd/p53的抗癌作用也存在腫瘤細胞“耐藥”現(xiàn)象。因此，在分子水平及時活體評價p53對腫瘤細胞抗癌效果非常重要。

一般公認DWI是以水分子彌散特點為基礎(chǔ)的成像技術(shù)，活體的DWI上，組織水分子的擴散系數(shù)值受到許多因素的影響，如體液的流動、細胞的滲透性和溫度、毛細血管灌注、細胞內(nèi)外水的黏滯度、比例、膜通透性的方向等[14]，因此，DWI能反映組織的生物學特點，可提供組織生物物理特性的信息，如細胞的組織結(jié)構(gòu)、微結(jié)構(gòu)和微循環(huán)[15]。在實際工作中常用表觀擴散系數(shù)（ADC）值來代替真正的擴散系數(shù)，指數(shù)ADC即EADC用于顯示組織的彌散權(quán)重效果。如腫瘤細胞膜完整，細胞密實，彌散受限，彌散相對較慢，彌散曲線衰減較慢，ADC值較低[14]；腫瘤細胞壞死，細胞膜不完整，細胞稀疏，細胞間間隙擴大，彌散曲線衰減迅速，ADC值大，在高b值的DWI圖像上組織信號降低[14-15]。所以，高b值的DW-MRI能更敏感顯示腫瘤組織的組織病理特征[9，14-15]。

在臨床與臨床前期的研究結(jié)果提示DWI可作為反映治療效果的可靠指針[4-8]。對C26結(jié)腸癌荷瘤鼠模型經(jīng)阿霉素化療或氨基酮戊酸基的光動力治療，前者在治療后24～48 h、后者在治療后6～24 h腫瘤的彌散指數(shù)有意義增加[4]。對大鼠皮下橫紋肌肉瘤移植模型給予血管靶性治療藥（Combretastatin）的研究[5]，用藥后1 h和6 h，ADC值降低，組織病理顯示腫瘤血管充血或閉塞，無腫瘤壞死，2 d后ADC升高，組織學檢查見腫瘤進行性壞死，9 d后ADC值降低與腫瘤再生有關(guān)，認為測量ADC值可能區(qū)分無灌注而又存活的細胞與無存活的壞死腫瘤組織。在對人類膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型經(jīng)5-FU聯(lián)合TRAIL/APO2L治療后2 d、3 d可見腫瘤ADC值有意義增加，并與腫瘤細胞的凋亡增加相關(guān)[6]。人類膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型腫瘤內(nèi)注射化療藥BCNU后24 h可見ADC值有意義增加，并與隨后的腫瘤縮小有相關(guān)性[7]。臨床研究提示[8]，對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的患者全程化療后3周行DWI，對化療有效的病灶ADC值有意義的增加。上述的一系列研究結(jié)果表明DWI可在腫瘤大小發(fā)生改變前，及時監(jiān)測抗癌藥對腫瘤細胞的療效，在早期評價抗癌藥物對腫瘤細胞的抗癌效果是一很有潛力的工具。

關(guān)于rAd/p53治療腫瘤療效評價的實驗與臨床研究，均采用觀察腫瘤大小改變、組織病理改變與臨床觀察[1-3]，目前未見rAd/p53治療腫瘤后用DWI評價其療效的實驗與臨床研究。本研究結(jié)果可見，治療后5個觀察時間點可見腫瘤中央與邊緣的ADC值大多增加，EADC值降低。ADC值與TUNNEL及western blot提示的腫瘤凋亡增加，p53表達增加呈正相關(guān)，EADC值呈負相關(guān)。腫瘤中央壞死區(qū)域ADC值高于周邊區(qū)域，EADC值低于周邊區(qū)域，但治療組周邊區(qū)域ADC值較對照組明顯升高，EADC值明顯降低，組織病理可見完整腫瘤細胞，提示rAd/p53可能通過滲透至周邊區(qū)域，引起腫瘤細胞膜內(nèi)外水分子擴散改變。

總之，DWI的ADC圖、EADC圖及相應的ADC值和EADC值可在治療后24 h即可出現(xiàn)有統(tǒng)計意義的改變，可作為單純rAd/p53或聯(lián)合化療治療腫瘤早期療效活體評價的生物標記物。

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