冉玲苓，石宏新，尹志剛

（1．黑龍江大學(xué) 電子工程學(xué)院，哈爾濱 150080；2．黑龍江科技學(xué)院 理學(xué)院，哈爾濱 150027）

0 引 言

光鑷是一種以激光的力學(xué)效應(yīng)為基礎(chǔ)的物理工具，是強會聚光場與微粒相互作用時形成的光學(xué)勢阱。貝爾實驗室的A．Ashkin在這一領(lǐng)域做出了開創(chuàng)性的工作。1970年，A．Ashkin首次在實驗室中觀察到激光的輻射力，成功地完成了激光懸浮微粒的實驗［1］，他提出了利用光壓操縱微粒的思想，并建立了一套利用光壓來操縱微粒的工具［2－3］。

光鑷技術(shù)出現(xiàn)之后，A．Ashkin和J．Dziedzic分別對病毒和細菌進行了捕獲和操控的實驗［4－5］，實驗結(jié)果證明適當(dāng)?shù)募す夤β蕦ι锝M織不會造成明顯的損傷。隨后，研究者們陸續(xù)利用光鑷技術(shù)開展了細胞融合、硅球排列、細胞分離、測定馬達蛋白作用力及運動步幅、克服分子馬達引起的細胞旋轉(zhuǎn)動力等多方面的工作［6］。這充分表明光鑷技術(shù)是一項極具活力的新興技術(shù)，它的出現(xiàn)為生命科學(xué)等多方面的發(fā)展提供了新的研究手段。

天津大學(xué)首先提出了飛秒激光光鑷的概念，他們提出飛秒激光光鑷與連續(xù)光光鑷不同的是在飛秒光鑷中作用在粒子上的光學(xué)梯度力是脈沖式［7］；王清月領(lǐng)導(dǎo)的課題組以高重復(fù)率飛秒激光為光源對血紅細胞、白細胞、聚苯乙烯微球、病毒等均實現(xiàn)了穩(wěn)定捕獲，并比較了飛秒激光與連續(xù)激光的捕獲能力。他們對單細胞的操作和光動力學(xué)對癌細胞的診斷和治療方面進行了研究，提出了光動力治療法［8］；圣德安魯斯大學(xué)的研究小組采用單光束梯度力光阱對1．28μm的硅球進行了研究［9］；M．Gu等人利用飛秒激光單光束梯度力光阱，測量了黃綠熒光10μm微球的雙光子激發(fā)效應(yīng)與形貌的依賴關(guān)系［10］；韓國延世大學(xué)的研究小組分別使用飛秒激光光阱和連續(xù)激光單光束梯度力光阱對生物細胞進行了捕獲和操縱，他們把隨著粒子的減小捕獲效率的差異不斷增大這一現(xiàn)象歸因于飛秒激光自聚焦效應(yīng)［11－12］。

自A．Ashkin等人發(fā)明光鑷后，光鑷由于其非接觸、無損傷操縱微納米尺度粒子的特性而被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理、材料等學(xué)科領(lǐng)域，被認為是最理想的單分子、單細胞、微粒等微納器件的操控工具。飛秒激光是一種發(fā)展迅速的超短脈沖激光，相對于納秒或皮秒激光脈沖，飛秒激光脈沖具有極短的脈沖寬度和極高的峰值功率，因此飛秒激光作為光鑷的光源與生物組織相互作用時幾乎不傷及周圍區(qū)域，因而具有極高的空間分辨率。目前作者利用飛秒激光顯微操作系統(tǒng)實現(xiàn)了對人體血紅細胞、酵母細胞的穩(wěn)定捕獲。

1 實驗部分

1．1 實驗裝置

飛秒激光光鑷系統(tǒng)主要由飛秒激光光源、功率調(diào)節(jié)器、光束耦合器、顯微鏡主體、載物臺與CCD圖像顯示系統(tǒng)幾部分組成，基本的光路見圖1。

圖1 飛秒光鑷系統(tǒng)的基本光路圖Fig．1 Basic beam path of femtosecond optical tweezers system

本文采用Ti：sapphire激光器作為飛秒激光光鑷系統(tǒng)的光源，泵浦光中心波長為532nm，激光器輸出的飛秒脈沖序列的中心波長為800nm，脈沖寬度為120fs，重復(fù)頻率為76MHz。將光束嚴格調(diào)整引入顯微鏡后，經(jīng)鏡物聚焦后形成光學(xué)勢阱。借助于顯微鏡配備的照明系統(tǒng)，可以對飛秒激光光鑷的捕獲過程進行實時地觀察。高倍率大數(shù)值孔徑的物鏡可以實現(xiàn)強梯度光場，并且具有較高的放大倍率，便于清楚地觀察光鑷對物體的操縱過程。但大數(shù)值孔徑同時也意味著工作距離短，尤其在筆者的實驗中采用的是正置式顯微鏡，由于受此限制，待捕獲樣品必須置于特制的培養(yǎng)皿中，其厚度不得大于顯微鏡物鏡的工作距離。本文通過衰減片可以對激光強度進行連續(xù)調(diào)節(jié)。飛秒激光脈沖通過顯微鏡的物鏡聚焦到樣品之前經(jīng)過耦合光路使光與顯微鏡內(nèi)置光路同軸并齊焦。顯微鏡的載物臺放置在由3個線性激勵源控制的XYZ三維移動平臺上。激勵源由計算機進行控制，同時通過CCD圖像顯示系統(tǒng)實時監(jiān)控操作過程，并進行圖像的采集。

1．2 實驗方法與結(jié)果

開啟照明燈，打開CCD攝像記錄程序，調(diào)整照明光源的亮度，使CCD圖像亮度適中，視場清晰。選用100×數(shù)值孔徑為0．9的物鏡聚焦激光束捕獲酵母細胞，配合粗調(diào)和精調(diào)手輪緩慢調(diào)焦，在顯示器視頻窗口觀察，使樣品池中的樣品圖像清晰。調(diào)節(jié)樣品臺手柄控制樣品臺的移動，選擇要捕獲操作的區(qū)域。將光阱位置靠近待捕獲的酵母細胞。

圖2為橫向捕獲一個酵母細胞的記錄過程。實線圓圈指示的是被捕獲的酵母細胞，虛線圓圈指示為參考細胞。圖2中箭頭方向指示三維移動平臺的移動方向，筆者觀察到背景中的酵母細胞跟隨平臺移動，而被捕獲的酵母細胞被光阱束縛而不動，即實現(xiàn)了飛秒光鑷操控酵母細胞水平平移。同樣筆者也進行了飛秒光鑷操控酵母細胞豎直方向的平移運動以及斜線方向的運動。在圖3中給出了豎直平移操控的記錄圖像。在捕獲圖像中可以看到，被捕獲的酵母細胞的圖像逐漸變虛，說明酵母細胞已離開成像的物平面，此時需要縱向調(diào)整焦距才可以重新看清樣品。這是由于當(dāng)激光功率過大時，產(chǎn)生的散射力推動樣品向前運動而離開物平面。這也說明此數(shù)值孔徑物鏡聚焦激光束會聚角小，光強梯度小以至捕獲的穩(wěn)定性較差。

在飛秒光鑷操控酵母細胞運動的過程中發(fā)現(xiàn)在酵母細胞相對背景移動的路徑上如果遇到其它的酵母細胞有時會同時捕獲多個酵母細胞，并同時隨光阱移動；有時則會出現(xiàn)失去對原本捕獲的酵母細胞而捕獲移動路徑上遇到的新的酵母細胞。發(fā)現(xiàn)軸向可以捕獲多個細胞的現(xiàn)象是由于軸向會聚度不夠高所致，其光阱在軸向上尺寸大于徑向，垂直方向上可以容納多個細胞。而對于交換捕獲細胞的現(xiàn)象筆者分析是因為在移動過程中，移動路徑上遇到的酵母細胞所處的軸向深度比原始被捕獲的細胞對于光阱來說位置更佳，所以占據(jù)了被捕獲的位置。

血紅細胞呈雙凹圓盤狀 （碟狀），直徑約為7 μm，未經(jīng)激光照射時，細胞自由懸浮于濃度為0．9%的生理鹽水中，并作隨機的布朗運動。操控記錄見圖4，圖中用黑色圓圈指示待捕獲細胞，箭頭方向指示平臺的移動方向。

飛秒激光光阱位置固定不變，通過計算機控制平臺的移動，將待捕獲細胞移向光阱位置，當(dāng)細胞接近激光光斑約數(shù)μm時，細胞就快速的被吸引至光斑中心。受激光照射后細胞在光學(xué)力的作用下發(fā)生空間翻轉(zhuǎn)，其碟面垂直于載物臺，觀察到被捕獲的細胞變?yōu)殚L條啞鈴形，見圖4。繼續(xù)以一定速度移動載物臺，其它自由細胞隨之移動，而被捕獲的細胞在光學(xué)勢阱的作用下靜止不動，充分證明了血紅細胞已經(jīng)被飛秒激光脈沖穩(wěn)定捕獲。若停止飛秒激光的照射，被捕獲細胞則快速恢復(fù)到初始的自由運動狀態(tài)。

圖4 飛秒激光對血紅細胞的捕獲過程Fig．4 Progress of femtosecond laser control the red blood cells

2 光鑷捕獲酵母細胞的能力

實驗結(jié)果清楚的展現(xiàn)了飛秒光鑷捕獲酵母細胞的全過程。這里本文討論飛秒光鑷的捕獲能力，一般通過比較Q值來衡量光鑷的捕獲能力，同時筆者也可以對其捕獲對象所受的光阱力進行測量，以酵母細胞為捕獲對象來進行光阱力的測量和Q值的計算。

2．1 酵母細胞所受光阱力的測量

在相對靜止的液體環(huán)境中，用光來捕獲一個酵母細胞，通過手動或計算機控制樣品臺，令被捕獲細胞相對周圍環(huán)境在平面上產(chǎn)生定向運動。光鑷的一個較重要的功能就是微小力的測量。知道光阱力與位移的關(guān)系就可以測定外力的大小。因為光阱中的粒子偏離光阱中心時，粒子將受到一個指向光阱中心的光阱力，起到回復(fù)力的作用。當(dāng)光阱中心的微粒受到其它外力時，微粒將偏離光阱中心，發(fā)生位移到一個新的位置，在新的位置處粒子受到的光阱力與外力平衡。光鑷系統(tǒng)的阱力標(biāo)定通常可以采用流體力學(xué)法、熱運動分析法、功率譜法和外加周期驅(qū)動力法。在筆者的工作中使用最常用的實驗方法流體力學(xué)法來測量飛秒光鑷捕獲酵母細胞的光阱力。流體力學(xué)的方法是以一定流速的穩(wěn)恒流體中，粒子受到的流體對它的黏滯力為標(biāo)準力，可以由流體力學(xué)中的Stokes公式給出：

其中η為黏滯系數(shù)；r為被捕獲細胞的半徑；ˉv為流體相對微粒的速度。

根據(jù)此公式可以算出光鑷的光阱力，細胞在光阱中受到的力與細胞偏離光阱中心的距離有關(guān)。

實驗中，光鑷系統(tǒng)中的光路調(diào)整后，液體相對微粒的運動是平臺帶動的。當(dāng)微粒進入光阱后，開始手動令平臺以較小的速度運動，若細胞仍在光鑷的控制中即處于被捕獲的狀態(tài)，則可以通過計算機控制逐步加大平臺的移動速度，這樣不停地調(diào)整平臺移動速度，直到平臺的速度達到某種臨界值，被捕獲的細胞不再受光阱束縛，能夠從光阱中逃逸出去，此時的平臺移動速度即為細胞的逃逸速度。將這個速度值代入Stokes公式，即可求出光阱力的大小。

由于實驗室設(shè)備的局限，只能測得細胞逃逸時的平均速度?？紤]到平臺啟動時對細胞的加速影響較大，因此通過直接設(shè)定平臺移動速度來測量逃逸速度的誤差將比較大，所以采取手動的方法來測量逃逸速度。手動測量逃逸速度的方法使用CCD攝像機來跟蹤采集一系列捕獲過程，對采集到的影像文件進行分割處理，截取出細胞逃逸前后兩幀連續(xù)的圖像，測出逃逸前后細胞的位移再除以兩幀圖像的時間間隔，可以計算出逃逸速度。在具體的實驗過程中，分別選用了不同的激光入射功率：30、40、50、60、80mW。為了盡量減小實驗以及處理數(shù)據(jù)時帶來的誤差，分別對多組位置進行重復(fù)測量。表1中給出功率為30mW時的實驗數(shù)據(jù)。

表1 酵母細胞0．04s時間內(nèi)位移變化Table 1 Displacement of yeast cells in 0．04s

用統(tǒng)計方法求出速度平均值的標(biāo)準偏差：

速度為：

這里測量的隨機誤差較大，是實驗誤差的主要來源。在光阱力的測量中，最大速度應(yīng)該是逃逸速度，即細胞掙脫光阱力的束縛一剎那的速度，這個速度為瞬時速度，在實驗中是手動移動細胞，不可避免會出現(xiàn)非勻速的情況。使用CCD拍攝的影像記錄通過軟件進行截圖后通過計算處理得到，其處理過程中多處步驟會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)，因此計算結(jié)果只是一個粗略的近似值。

2．2 飛秒激光光鑷捕獲酵母細胞的Q值

Q值一般可由下式表示［9］：

其中η為流體的黏滯系數(shù)；d為樣品微粒的直徑；k為深度影響因子［13］，在本實驗中，樣品位于溶液的中部，k取值1；c為光速；v為逃逸速度；n為樣品周圍液體的折射率；p為照射到樣品上激光的平均功率。

由式 （2）可見，在實驗條件相同時，光鑷的捕獲能力取決于逃逸速度與平均功率的比值。在光阱力的研究中筆者已經(jīng)測得不同飛秒激光平均功率下被捕獲細胞的逃逸速度。這里給出實驗獲得的v～p關(guān)系見圖5。由圖5可見，隨著入射激光功率的增加，細胞的逃逸速度隨之不斷增加。入射激光功率增大，激光作用于細胞的梯度力也隨之增大，能夠束縛細胞使之運動的速度也增大。但逃逸速度并不隨入射激光功率的增大而線性增大，且斜率是逐漸減小的。根據(jù)式 （2）中各個量之間的關(guān)系可以得出Q值隨著入射激光功率的增加將越來越小。由表1中的實驗數(shù)據(jù)計算出了飛秒光鑷的Q值，平均值為0．007。

圖5 逃逸速度和照射到酵母細胞上激光平均功率的關(guān)系圖Fig．5 Escape speed versus the average power on the yeast cells

3 結(jié) 論

本文介紹了自行搭建的飛秒光鑷系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)及各組成部件的功能。利用該系統(tǒng)分別對人體血紅細胞和酵母細胞進行了捕獲和操縱的實驗，對實驗結(jié)果進行了對比和定性分析。通過流體力學(xué)方法對酵母細胞所受到的光阱力進行了定量的測量并給出計算結(jié)果，所得到的光阱力大小在皮牛頓量級。

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