季宇彬，孟凡影，曲中原，鄒 翔

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

白屈菜堿(chelidonine)是從罌粟科白屈菜屬植物白屈菜(Chelidonium majus L.)全草中提取分離出的苯并菲啶類生物堿[1]，是白屈菜的有效成分之一.目前發(fā)現(xiàn)它除了具有顯著的鎮(zhèn)痛作用外[2]，還對胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌有抑制作用[3].本文前期研究表明，白屈菜堿對人胃癌SGC-7901細胞生長有抑制作用，并可將其阻滯于G2/M期.本文主要研究白屈菜堿對人胃癌SGC-7901細胞中Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表達的影響，探討白屈菜堿誘導(dǎo)SGC-7901細胞發(fā)生G2/M期阻滯的分子機制.

1 實驗材料

1.1 腫瘤細胞株

人胃癌SGC-7901細胞株，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.

1.2 藥物與主要試劑

白屈菜堿(質(zhì)量分數(shù)98%，深圳美荷生物科技有限公司)，注射用硫酸長春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司).RPMI 1640培養(yǎng)基及胰酶(美國Gibco公司).兔抗Cdk1/Cdc2多克隆抗體、兔抗p-Cdk1/Cdc2(Thr14)多克隆抗體(Bioworld生物技術(shù)有限公司)，兔抗cyclin B1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，堿磷酶標記羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)研究所).

1.3 主要儀器

超凈工作臺(DL-CJ-1N醫(yī)用型)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(CO-150型)(美國NBS公司)，Adventurer萬分之一電子天平(OHAUS公司)，電泳儀(Bio-Rad公司)，垂直電泳轉(zhuǎn)印槽(北京六一儀器廠)，高速低溫離心機(美國Beckman-Coulter公司)，Tannon凝膠成像系統(tǒng)GIS-2019(Tannon公司).

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及給藥

人胃癌細胞株SGC-7901常規(guī)方法復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，體積分數(shù)為5%的CO2，相對濕度95%)培養(yǎng).0.25%胰酶消化傳代.取對數(shù)生長期細胞，設(shè)白屈菜堿給藥組白屈菜堿(終濃度為6.25、12.5、25μmol/L)，硫酸長春新堿陽性對照組(終濃度為5μmol/L)，陰性對照組(加相同體積的培養(yǎng)液RPMI 1640)，進行后續(xù)實驗.

2.2 Western Blot法檢測白屈菜堿對SGC-7901細胞Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表達的影響

取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的白屈菜堿和陽性對照藥，48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，用細胞刮刮下細胞.加細胞裂解液，于冰上裂解1.5 h，于4℃下12 000 r/min離心10 min，取離心后的上清，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量后，分裝轉(zhuǎn)移至離心管中放于-86℃保存?zhèn)溆?取蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)移到NC膜上，將一抗用5%脫脂奶粉稀釋，將膜與一抗置于封閉的塑料袋中在4℃冰箱中孵育過夜.過夜后，TBST緩沖液充分洗膜3次，每次振搖10 min，再與堿磷酶標記羊抗兔IgG室溫孵育2 h.沖洗未結(jié)合二抗，TBST搖洗3次，每次8 min.膜轉(zhuǎn)移至一淺托盤，室溫溫育，當?shù)鞍讕ь伾疃冗_到要求(約20 min)，去離子水沖洗濾膜.濾紙包住保存，Tannon凝膠成像系統(tǒng)照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統(tǒng)進行量化分析.

2.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均重復(fù)3次.實驗結(jié)果采用SPSS 16.0進行One-Way ANOVA分析，結(jié)果以表示.

3 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如圖1～3所示，白屈菜堿作用SGC-7901細胞48 h后，可顯著下調(diào)Cdk1，cyclinB1蛋白的表達(P＜0.01)，同時顯著上調(diào)p-Cdk1(Thr14)蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01).

圖1 白屈菜堿對SGC－7901細胞Cdk1蛋白表達的影響

4 討論

大量實驗表明，白屈菜堿對肝癌HepG-2細胞[4]、白血病L1210細胞[3]、人鼻咽癌KB細胞[5]等均有抑制作用，是一種潛在的腫瘤治療藥物，但其抗腫瘤活性可通過不同途徑介導(dǎo).本文前期研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜堿可將人胃癌SGC-7901細胞阻滯于G2/M期.

在細胞周期中，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDKs和細胞周期蛋白cyclins是主要的細胞周期調(diào)控分子，其中與G2/M期有關(guān)的是Cdk1和cyclinB1.Cdk1是G2/M期的關(guān)鍵蛋白，Cdk1的活化是細胞由G2期進入M期的必要條件[6]，Cdk1上的15位酪氨酸和14位蘇氨酸殘基使Cdk1高磷酸化，從而抑制了Cdk1的活性引起G2/M期阻滯.而cyclinB1是特異的G2/M期周期素，Cdk1與cyclinB1復(fù)合物的活化是啟動有絲分裂的關(guān)鍵，同樣是G2期進入M期的必要條件[6].而本文研究結(jié)果表明，白屈菜堿可顯著下調(diào)人胃癌SGC-7901細胞中Cdk1和cyclinB1蛋白的表達水平，這樣也直接導(dǎo)致了Cdk1和cyclinB1的復(fù)合物的減少[7].此外，白屈菜堿還可顯著上調(diào)人胃癌SGC-7901細胞中p-Cdk1(Thr14)蛋白的表達水平，表明白屈菜堿可使SGC-7901細胞大部分的Cdk1處于磷酸化狀態(tài)而不能活化，進而將SGC-7901細胞住阻滯于G2/M期，但其更加深入的分子機制尚待進一步研究.

[1]黃 松，杜方麓.罌粟科白屈菜族的化學(xué)成分及植物化學(xué)分類依據(jù)的研究進展[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，2002，10(8):582-584.

[2]何志敏，佟繼銘，宮鳳春.白屈菜堿鎮(zhèn)痛作用研究[J].中草藥，2003，34(9):837-838.

[3]韋祖巧，鄒 翔，曲中原，等.白屈菜化學(xué)成分和藥理作用的研究進展[J].中草藥，2009，40(S1):38-40.

[4]NOUREINIS K，WINK M.Transcriptional down regulation of hTERT and senescence induction in HepG2cells by chelidonine[J].World JGastroenterol 2009，15(29):3603-3610.

[5]楊秀偉，冉福香，王瑞卿.44種生物堿類化合物對人鼻咽癌細胞株KB和人白血病細胞株HL-60細胞增殖抑制活性的篩選[J].中國現(xiàn)代中藥，2007，9(1):8-13.

[6]OBAYA A J，SEDIVY JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalin cells[J].Cell Mol Life Sci.，2002，59(1):126-42.

[7]CHEN H，HUANG Q，DON J，et al.Over expression of CDC2/VyclinB1 in gliomas，and CDC2 depletion inhibits proliferation of human glioma cells invitro and invivo[J].BMC Cancer，2008，29(8):1-11.