舒 忻 馬大勇 林 彬 韓振蘊

1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院腦病科，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腦病科，北京 100700

參知健腦膠囊主要用于血管性癡呆“正氣虧虛兼濁毒絡(luò)阻”證。癥見智力減退、思維遲鈍、神情呆滯、健忘，或喜怒不定、心煩汗出、躁擾不安、少寐多夢等。為考察小鼠單次灌胃給予供試品后的急性毒性反應，為該藥的臨床前反復給藥的毒性研究和臨床研究提供參考信息而進行本試驗?，F(xiàn)將試驗總結(jié)如下：

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

參知健腦膠囊（批號：20100907，有效期至2012年3月7日），由人參莖葉總皂苷、知母提取物和赤芍提取物等按一定比例配伍而成，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供；滅菌注射用水（批號：20100701，有效期至2012年7月2日），由北京立時達藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物

4～5周齡SPF級昆明小鼠，雌雄各20只，體重雌性18.5～20.5 g，雄性：18.6～21.5 g，所有動物體重均不超過或低于同性別動物平均體重的20%。實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2009-0024。

1.3 動物飼養(yǎng)與管理

所有動物購入后，經(jīng)獸醫(yī)接收進行檢疫；SPF級環(huán)境動物房；標準SPF級鼠飼料（供應單位：北京科澳協(xié)力飼料有限公司；動物飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0012）；動物飲用純化水，用飲水瓶供應；刨花材質(zhì)的實驗室專用墊料；動物飼養(yǎng)于裝有墊料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒規(guī)格為長×寬×高＝295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分養(yǎng)，每盒最多飼養(yǎng)同性別5只動物。動物自由攝食，自由攝水；設(shè)定的動物房溫度范圍是20～25℃，實測溫度范圍是20.0～23.2℃。設(shè)定的動物房濕度范圍是40%～70%，實測濕度范圍是40%～60%。光照12 h明暗交替；墊料每周更換2次，同時更換鼠盒。每天更換高壓消毒過的飲水瓶和瓶塞。所有換洗的籠具清洗過后均采用高壓滅菌；籠架每周消毒1次，動物房地面每天消毒1次，動物房墻面每周消毒1次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用，每周交叉1次。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 給藥前從44只動物中挑選檢疫合格、體重相近的雌雄各20只動物，用區(qū)段隨機分組法，按性別將動物分為兩個區(qū)段，用Excel軟件給予每只動物一個隨機數(shù)，并按照隨機數(shù)從小到大的排序，將小鼠分為兩組，即陰性對照組和供試品組每組，雌雄各10只，其中陰性對照組動物給予滅菌注射用水。見表1。

1.4.2 供試品配制及給藥 稱取適量的供試品，用滅菌注射用水溶解，配成終濃度為200 mg/mL的供試品溶液。溶解后的供試品常溫保存；給藥途徑為灌胃，給藥頻率為單次給藥，給藥容量為25 mL/kg，給藥方法為動物灌胃前禁食過夜，藥后再禁食1 h。用一次性使用1 mL無菌注射器準確抽取所需溶液，用12號灌胃針經(jīng)口灌胃給藥；給藥方式選擇的理由是臨床擬用途徑為口服，本試驗采用經(jīng)口灌胃給藥，與臨床擬用途徑基本相同。

表1 動物的組別、劑量和動物號

1.5 檢測指標

1.5.1 臨床觀察 給藥后籠旁觀察，1 h內(nèi)連續(xù)觀察，每15 min記錄1次，1～4 h內(nèi)每1 h觀察1次；4 h后結(jié)束觀察；其他觀察時間：檢疫馴養(yǎng)期和給藥后次日開始，每天上午和下午各進行1次一般臨床觀察，第7天和第14天進行詳細臨床觀察，觀察期為14 d。在同一時間段，一般臨床觀察與詳細臨床觀察不重復實施。一般臨床觀察內(nèi)容主要包括籠旁觀察動物死亡或瀕死情況、精神狀態(tài)、行為活動、進食情況、糞便性狀等；詳細臨床觀察內(nèi)容：精神狀態(tài)、行為活動、皮膚、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛門、四肢、足和呼吸等。

1.5.2 體重 給藥前、第8天、第15天測定動物體重。

1.5.3 食量 每周加料1次，第8天、第15天稱取每籠剩余飼料量，據(jù)加料量和剩余飼料量算出平均每天每只動物食量，以 g/只/天表示。

1.5.4 病理檢查 所有動物均進行大體解剖，大體解剖所見異常的組織器官進行組織病理學檢查。

1.6 動物安樂死方法

觀察期結(jié)束（第15天）所有存活動物，使用CO2吸入麻醉法將動物麻醉，之后股動脈放血安樂死。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，分析動物體重和食量的變化趨勢，根據(jù)病理檢查和臨床觀察結(jié)果，綜合判斷供試品的急性毒性反應情況。動物體重進行獨立樣本的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

給藥后，連續(xù)觀察4 h，動物呼吸平穩(wěn)、活動正常，未見異常反應。14 d的觀察期間，未見動物發(fā)生死亡或瀕死，各組動物精神狀態(tài)、行為活動等均未見明顯異常。

2.2 體重

試驗期間，各組動物的體重增長趨勢相似，供試品給藥組動物體重與同期同性別陰性對照組動物比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠體重變化情況（±s，g）

表2 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠體重變化情況（±s，g）

性別 組別 劑量（mg/只） 只數(shù) 給藥前 第8天 第15天雌性0雄性陰性對照組供試品組陰性對照組供試品組5 000 0 5 000 10 10 10 10 19.6±0.6 19.4±0.8 19.7±0.8 19.3±0.6 28.1±1.1 28.3±1.8 34.3±2.7 32.0±2.2 31.6±2.2 32.0±1.8 41.8±3.2 39.1±3.0

2.3 食量

供試品組與同期同性別陰性對照組動物的攝食量相似，未見藥物對動物食量有明顯影響。見表3。

表3 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠食量變化情況（±s，g/只/天）

表3 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠食量變化情況（±s，g/只/天）

性別 組別 劑量（mg/只） 只數(shù) 第1周 第2周雌性0雄性陰性對照組供試品組陰性對照組供試品組5 000 0 5 000 2222 4.80±0.14 4.85±0.07 6.50±0.14 6.00±0.00 4.85±0.35 5.05±0.21 7.25±0.07 6.90±0.28

2.4 病理檢查

所有動物均按計劃安樂死，進行大體解剖觀察，各組織臟器均無肉眼可見異常改變。

2.5 影響研究可靠性和造成研究工作偏離實驗方案的異常情況

試驗中未見可能影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況。

3 討論

參知健腦膠囊是以王永炎院士提出的血管性癡呆“正虛毒損絡(luò)阻”創(chuàng)新病因病機學說為指導研發(fā)而得[1-4]，主要由人參、知母、赤芍等藥物提取物按一定比例優(yōu)化配伍而成[5]，具有扶正、通絡(luò)、解毒的功效[6-7]，是國家重大新藥創(chuàng)制項目的候選新藥。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有提高擬癡呆模型動物的學習記憶能力、改善腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及作用、減少神經(jīng)細胞凋亡、保護海馬神經(jīng)元和突觸、增加血管新生、保護腦損傷等作用[8-12]，知母提取物能夠改善癡呆動物的學習記憶能力、良性調(diào)節(jié)癡呆動物的膽堿能系統(tǒng)及清除自由基等[13-17]。芍藥提取物可以提高癡呆動物的學習記憶能力，對神經(jīng)細胞缺氧、缺糖、氧自由基及一氧化氮神經(jīng)毒性等損傷有顯著保護作用[18-20]。

前期動物研究中發(fā)現(xiàn)，參知健腦膠囊可明顯改善大鼠的學習、記憶功能，減輕其海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞損傷，增加癡呆大鼠海馬組織中Ach的水平[21]，并可通過降低細胞內(nèi)ROS水平，拮抗Aβ引起的細胞毒性，抑制細胞凋亡，而具有治療神經(jīng)退行性疾病的功效[6]。

在本試驗條件下，參知健腦膠囊單次灌胃給予昆明小鼠，在5 000 mg/kg的劑量下，未見小鼠出現(xiàn)毒性反應。按體重計算，此劑量相當于臨床擬用劑量的286倍。說明參知健腦膠囊安全劑量范圍較廣，安全性較好。

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