李 敏 滑蓉蓉 于愛(ài)學(xué) 張芳芳 代廣輝 王曉東 程洪斌 安沂華

武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院神經(jīng)干細(xì)胞移植科，北京 100039

肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是一種病因未明、選擇性侵犯脊髓、腦干及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性變性疾病?；颊邚淖畛醢l(fā)現(xiàn)癥狀開始，平均僅能存活3～5年。發(fā)病以中老年人為主，青少年少見，平均發(fā)病年齡約59歲，發(fā)病率在1/10萬(wàn)～3/10萬(wàn)，有家族性傾向[1]。因?yàn)樵摬〉牟∫蚴嵌嘁蛩氐?，至今不是很清楚，因此?dāng)前無(wú)實(shí)質(zhì)性減緩疾病進(jìn)展的治療手段。由美國(guó)FDA獲準(zhǔn)在臨床應(yīng)用的利魯唑（Riluzole），是一種興奮性氨基酸受體阻滯劑，對(duì)延長(zhǎng)患者存活期有一定作用[2]。但是并沒(méi)有逆轉(zhuǎn)患者病情的作用。

干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，目前研究較多的干細(xì)胞種類包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能性干細(xì)胞等。由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，且具有獲取簡(jiǎn)便、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議、增殖力強(qiáng)、來(lái)源廣泛、不導(dǎo)致免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)[3]，成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)2005年1月～2008年12月于我科就診接受干細(xì)胞治療的99例MND患者進(jìn)行分析，其中男64例（64.6%），女35 例（35.4%）。年齡 32～73 歲，平均（52.9±9.3）歲。 病程 4～120個(gè)月，平均病程（26.0±19.5）個(gè)月。依據(jù)1994年世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟在西班牙EI Escorial會(huì)議上制定的肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，本組均為確診ALS。

1.2 評(píng)分

1.2.1 ALSFRS（A）評(píng)分 ALSFRS評(píng)分包括語(yǔ)言、唾液分泌、吞咽、書寫、切斷食物和使用餐具、穿衣和衛(wèi)生保健、在床上翻身和整理衣物、行走、攀登樓梯以及呼吸共十個(gè)項(xiàng)目，總分0～40分，分值越低，神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。但是此項(xiàng)評(píng)分方法的缺點(diǎn)是對(duì)于延髓功能的評(píng)測(cè)指標(biāo)太少，只有一項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 Plaitaks（P）評(píng)分以及改良Plaitaks評(píng)分 由于ALSFRS評(píng)分方法存在不足，因此本項(xiàng)課題同時(shí)又使用另一種臨床評(píng)價(jià)方法——Plaitaks評(píng)分，此項(xiàng)評(píng)分在詳細(xì)地評(píng)價(jià)四肢肌力的同時(shí)，還對(duì)延髓功能做了專門的評(píng)價(jià)。該項(xiàng)評(píng)分方法的滿分為165分，分值越高神經(jīng)功能損傷越輕，但是通過(guò)臨床驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)此方法還存在著不足——缺少對(duì)軀干活動(dòng)以及呼吸功能的評(píng)分，因此本課題在此基礎(chǔ)上稍加改良，以便達(dá)到更好地對(duì)ALS運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)的目的。改良的Plaitaks（滿分204分）評(píng)分在原有評(píng)分基礎(chǔ)上，增加了兩個(gè)方面的評(píng)價(jià)：①在脊髓功能項(xiàng)中增加了對(duì)雙側(cè)的頸部屈曲、頸部伸展和聳肩的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，每項(xiàng)評(píng)定采用6級(jí)分法；②延髓功能中增加了咀嚼運(yùn)動(dòng)。除了脊髓功能和延髓功能兩項(xiàng)外，還增加了一大項(xiàng)——呼吸肌力量，包括吸氣運(yùn)動(dòng)和呼氣運(yùn)動(dòng)（正常3分，輕度損傷2分，中度損傷1分，嚴(yán)重?fù)p傷0分）。

1.3 干細(xì)胞治療

1.3.1 干細(xì)胞來(lái)源 采自健康的正常孕周的剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶，孕婦術(shù)前各項(xiàng)檢查包括：血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能、肝功能、腎功能、血糖、血脂檢查結(jié)果都正常；梅毒和艾滋病抗體陰性；無(wú)甲、乙、丙型肝炎；無(wú)家族性、遺傳性疾病病史。

1.3.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程 具體方法：經(jīng)孕婦簽署書面同意書后，于剖腹產(chǎn)手術(shù)中取臍帶約10 cm，無(wú)菌條件下分離、培養(yǎng)、傳代。收集第4～6代的細(xì)胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，然后用于移植。

1.3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用到臨床的標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)用到臨床之前，首先對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行各種檢測(cè)，包括：①細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)；②細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)；③無(wú)菌檢測(cè)；④支原體檢測(cè)；⑤內(nèi)毒素檢測(cè)：鱟試劑檢查法結(jié)果陰性（根據(jù)2000年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法）。

1.3.4 臨床治療過(guò)程 術(shù)前收集干細(xì)胞并用生理鹽水將其制備成2 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為0.5×107/mL，將其吸入1 mL注射器。常規(guī)進(jìn)行腰椎穿刺，進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔后，緩慢采集2 mL腦脊液，然后將2 mL細(xì)胞懸液緩慢注入?；颊呷フ砥脚P6 h。監(jiān)測(cè)患者血壓、心率、血氧、呼吸24 h。1周以后重復(fù)1次，總共進(jìn)行4次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，治療前后ALSFRS評(píng)分、原始Plaitaks評(píng)分以及調(diào)整Plaitaks評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)符合正態(tài)分布，治療前后評(píng)分比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般病例資料結(jié)果

在99例確診ALS患者中年齡最小的32歲，最大的73歲，平均（52.9±9.3）歲，且住院時(shí)的病程為 4～120 個(gè)月，平均病程（26.0±19.5）個(gè)月。這比國(guó)際上公布的平均發(fā)病年齡（55歲）要早。另外性別比例男64例（64.6%），女35例（35.4%），男性的發(fā)病率明顯高于女性。

2.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物

CD90+100%，CD44+99.82%，CD73+100%，CD105+99.95%，CD45，CD34，CD19，CD11b 表達(dá)率小于 2%。

2.3 干細(xì)胞治療結(jié)果

99例患者在移植前以及移植后分別進(jìn)行A評(píng)分，P評(píng)分以及改良的P評(píng)分，三種評(píng)分結(jié)果在應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析后結(jié)果P值均＜0.001（表1），說(shuō)明干細(xì)胞治療 ALS是有效的，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義。

表1 干細(xì)胞治療ALS前后評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 隨訪結(jié)果

99例ALS移植治療后隨訪半年，失訪19例（19.2%），死亡 10例（10.1%），癥狀改善25例（25.3%），病情進(jìn)展 45例（45.5%）。在有效隨訪的人群中改善率為25/80（31.3%）。隨訪半年～1年，患者死亡 25例（25.3%），癥狀改善 4例（4.0%），病情進(jìn)展41例（41.4%）。隨訪 1～2年，患者死亡 28例（28.3%），癥狀改善 1例（1.0%），病情進(jìn)展 16例（16.2%）。

3 討論

MSC用于臨床應(yīng)用研究的種類主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，這兩類細(xì)胞都具有MSC共同的特點(diǎn)即低免疫源性。與成體階段與多種細(xì)胞共同生存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育階段更早，其所生長(zhǎng)的組織環(huán)境更為單純，因此便具有更強(qiáng)的增殖能力與分化能力，更低的免疫源性，更加強(qiáng)大的分泌因子能力，加之大量的細(xì)胞來(lái)源、方便的提取提純以及易于體外培養(yǎng)等特性，是選擇其為細(xì)胞來(lái)源的主要原因。

Mazzini等[5]應(yīng)用骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療ALS，將培養(yǎng)好的干細(xì)胞懸浮于自體腦脊液中，外科暴露胸段脊髓，在平T7～9水平脊髓局部移植。分別在移植后3～6個(gè)月行MRI檢查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脊髓結(jié)構(gòu)改變和異常細(xì)胞增殖，且一半的患者的下肢肌力減弱的趨勢(shì)漸趨緩和。而且長(zhǎng)期觀察已經(jīng)證實(shí)BMSC的培養(yǎng)擴(kuò)增和移植入人脊髓是安全的，在ALS患者可以耐受[6]。Karussis和他的同事在經(jīng)過(guò)大量的臨床前研究后，利用靜脈或者鞘內(nèi)注射MSCs治療ALS或者多發(fā)性硬化[7]，證實(shí)了兩種方法治療神經(jīng)系統(tǒng)變性病是安全有效地。因此本課題從安全角度考慮下選擇了使用腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射的方式移植干細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單、安全、創(chuàng)傷小。

本課題的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者接受干細(xì)胞治療后癥狀明顯改善，且移植前后的評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異，說(shuō)明干細(xì)胞治療ALS是有效的，通過(guò)臨床觀察，治療后患者的改善主要是①肌肉力量的增加；②四肢肌張力下降；③肌束震顫次數(shù)明顯減少；④言語(yǔ)及吞咽功能明顯好轉(zhuǎn)?？紤]到MSCs發(fā)揮作用的機(jī)制主要是①神經(jīng)替代作用；②神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用；③激活自身干細(xì)胞。人們利用添加某種遞質(zhì)（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）或者與人類神經(jīng)元共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)出神經(jīng)樣細(xì)胞，并且證明誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞存在某些神經(jīng)功能[8]。GDNF具有與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元高親和性的特性，能夠預(yù)防神經(jīng)元的死亡。Suzuki等[9]證明在大鼠身上證實(shí)了移植入肌肉的hMSCs能夠在肌肉中存活，并且可以不斷分泌GDNF，給予肌肉、神經(jīng)肌肉接頭持續(xù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持，從而減少ALS大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失，改善生存以及神經(jīng)功能。接受干細(xì)胞移植的部分ALS患者最短在移植后4 h即有明顯的神經(jīng)功能恢復(fù)，有研究證實(shí)ALS患者在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損之前，伴隨神經(jīng)肌肉接頭受損同時(shí)，有60%前根受損[10]。因此考慮干細(xì)胞如此早的發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)作用可能與干細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

在治療結(jié)束后的半年隨訪結(jié)果：失訪19.2%，死亡10.1%，癥狀改善25.3%，病情進(jìn)展45.5%，在有效隨訪的人群中改善率為25/80（31.25%）?？梢钥闯龃蟛糠只颊甙Y狀出現(xiàn)反復(fù)，病情復(fù)又進(jìn)展。這說(shuō)明干細(xì)胞治療ALS在短期內(nèi)確實(shí)有效，但是長(zhǎng)期療效還有待進(jìn)一步探討，從隨訪情況來(lái)看有效期維持在3～6個(gè)月，大部分患者在干細(xì)胞治療半年后又開始出現(xiàn)惡化趨勢(shì)。這是否從臨床方面說(shuō)明了干細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)或者免疫調(diào)節(jié)呢，亦或是干細(xì)胞在體內(nèi)的生存期大概在半年左右呢，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

從安全角度來(lái)看，所有的患者住院20余天期間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何不適癥狀。隨訪中發(fā)現(xiàn)大部分的死亡患者死因?yàn)楹粑ソ?，其次為飲食?dǎo)致的窒息。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何因?yàn)槊庖吲懦饣蛘吣[瘤導(dǎo)致的死亡。說(shuō)明了干細(xì)胞移植治療ALS是安全的。

[1]Rowland LP，Shneider NA.Amyot rophic lateral sclerosis[J].N Engl J Med，2001，344（22）：1688-1700.

[2]Miller RG，Mitchell JD，Lyon M，et al.Riluzole for amyotrophiclateral sclerosis（ALS）/motor neuron disease（MND）[J].Cochrane Database Syst Rev，2007，（1）：CD001447.

[3]Le BK，Pittenger M.Mesenchymal stem cells：progress toward promise[J].Cytotherapy，2005，7（1）：36-45.

[4]Brooks BR.EI Escorial world federation of neurology criteria for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis[J].J Neurol Sci，1994，124（Suppl）：S96.

[5]Mazzini L，F(xiàn)agioli F，Boccaletti R，et al.Stem cell therapy inamyo-trophic lateral sclerosis：A methodological approach in humans[J].Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord，2003，4（3）：158-161.

[6]Mazzini L，Mareschi K，F(xiàn)errero I，et al.Autologous mesenchymalstem cells：clinical applications in amyotrophic lateral sclerosis[J].Neurol Res，2006，28（5）：523-526.

[7]Karussis D， Kassis I， Kurkalli BG，et al.Immunomodulation and neuroprotection with mesenchymal bone marrow stem cells（MSCs）：a proposed treatment for multiple sclerosis and other neuroimmunological/neurodegenerative diseases[J].J Neurol Sci，2008，265：131-135.

[8]Kim HJ，McMillan E，Han F，et al.Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1[J].Stem Cells，2009，27：390-398.

[9]Suzuki M，McHugh J，Tork C，et al.GDNF secreting human neural progenitor cells protect dying motor neurons，but not their projection to muscle，in a rat model of familial ALS[J].PLOS ONE，2007，2：689.

[10]Fischer LR，Culver DG，Tennant P，et al.Amyotrophic lateral sclerosis isadistalaxonopathy：evidenceinmiceandman[J].ExpNeurol，2004，185：232-240.