陳志華，戴起寶，陳紹勤，林素勇

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，福建福州350005)

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因參與的、多階段多步驟的演變過程，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Kiss-1與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。隨著結(jié)直腸癌惡性演進(jìn)，Kiss-1基因表達(dá)下降，但具體原因尚不明確，可能與DNA啟動(dòng)子甲基化修飾參與調(diào)控抑癌基因的表達(dá)等因素有關(guān)。本研究通過檢測(cè)不同組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2011年4月至2011年8月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科腸鏡切取的142例正常結(jié)直腸組織、23例結(jié)直腸腺瘤、手術(shù)切除的73例新鮮結(jié)直腸癌瘤體及癌旁組織標(biāo)本，液氮保存。入選的結(jié)直腸癌病例術(shù)前未經(jīng)化療、放療;平均年齡59.28歲;男性39例，女性34例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例，其中肝臟轉(zhuǎn)移3例，肺部轉(zhuǎn)移2例。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒和蛋白酶K(北京白泰克公司)，亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚(Sigma公司)，Wizard DNA Clean-Up System試劑盒(Promega公司)，CpG甲基化酶M.SssⅠ(New England Biolabs公司)。Kiss-1基因引物參照文獻(xiàn)［1］設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)工程有限公司合成。見表1。

表1 Kiss-1基因甲基化特異PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 甲基化特異性PCR 應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取結(jié)直腸組織基因組DNA，定量后取2 μg DNA按照甲基化特異性PCR修飾DNA，修飾后DNA用Wizard DNA Clean-Up System試劑盒純化，并回收DNA，溶于20 μL滅菌去離子水，-20℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)體系25 μL，修飾后 DNA 3 μL，10 × Taq Buffer 2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，25 mmol·L-1MgCl21.5 μL，引物各 1 μL，Taq 酶 0.2 μL;反應(yīng)條件:95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物加入2 μL上樣緩沖液，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3.2 對(duì)照組設(shè)置 在每批PCR擴(kuò)增時(shí)均設(shè)置甲基化陽(yáng)性對(duì)照(CpG甲基化酶M.SssⅠ修飾后新鮮胎盤組織DNA為模板)、甲基化陰性對(duì)照(胎盤組織DNA為模板)和陰性對(duì)照(H2O為模板)。

1.3.3 結(jié)果判斷 DNA樣品經(jīng)甲基化特異性引物(M)和非特異性引物(U)擴(kuò)增，DNA markerⅠ標(biāo)記，是否為特異引物擴(kuò)展特異產(chǎn)物。M有特異產(chǎn)物，而U無(wú)產(chǎn)物，判斷為純合型甲基化陽(yáng)性;如果兩者都有特異產(chǎn)物，判斷為雜合型甲基化陽(yáng)性;如果U擴(kuò)展出特異產(chǎn)物，而M無(wú)產(chǎn)物，判斷為甲基化陰性;如果兩者均無(wú)特異產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)失敗，重做。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)結(jié)果 不同組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)結(jié)果見圖1。

2.2 Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的比較 結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為82.2%，癌旁組織為30.1%，結(jié)直腸腺瘤組織為21.7%，正常結(jié)直腸組織為6.3%，陽(yáng)性率在結(jié)直腸癌、癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤、正常結(jié)直腸組織中依次下降，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率的比較

2.3 Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表3。

3 討論

Kiss-1基因是Lee等［2］在黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，Kiss-1基因表達(dá)產(chǎn)物可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。國(guó)內(nèi)外研究［3-4］表明Kiss-1基因表達(dá)下降與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移特性和不良預(yù)后有關(guān)，本課題組前期研究［5-6］發(fā)現(xiàn)Kiss-1基因表達(dá)缺失可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，但Kiss-1基因表達(dá)水平改變的原因尚不明確。

表3 結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

基因異常甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的主要原因之一，腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子發(fā)生了異常甲基化，如結(jié)直腸癌組織中 MLH1、APC、MGMT、RASSF1A、P16 等基因均發(fā)現(xiàn)異常甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致基因表達(dá)下降，從而抑制其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、血管形成等方面發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移［7-8］。有研究［9］發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中 Kiss-1基因啟動(dòng)子異常甲基化，且與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與Kiss-1基因表達(dá)下降密切相關(guān)，促進(jìn)膀胱癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為82.2%，癌旁組織為30.1%，結(jié)直腸腺瘤組織為21.7%，正常結(jié)直腸組織為6.3%，在結(jié)直腸癌發(fā)生的不同階段，Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率有明顯差異，提示Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。隨著結(jié)直腸癌的分化程度降低、浸潤(rùn)深度進(jìn)展和轉(zhuǎn)移發(fā)生，Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化程度逐步增高，Kiss-1基因啟動(dòng)子異常甲基化有可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性演進(jìn)，Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化水平的檢測(cè)對(duì)臨床評(píng)估結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后可能有一定的參考價(jià)值。

DNA甲基化是一種可逆的過程，Yamashita等［1］應(yīng)用5-脫氧雜氮胞苷逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞珠Kiss-1基因啟動(dòng)子異常甲基化，發(fā)現(xiàn)Kiss-1基因的表達(dá)明顯升高，通過逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)亦有可能提高Kiss-1基因的表達(dá)水平，進(jìn)而降低結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移潛能，這為預(yù)防和治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供了新思路。

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