何山震 王淑俠 王 朋 翟創(chuàng)彥 周志凌

1（廣東省人民醫(yī)院PET中心，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣州 510080）

2（廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心 廣州 510080）

氨基聚醚(Kryptofix 2.2.2，K-222)的化學(xué)名為4,7,13,16,21,24-六氧雜-1,10-二氮雜雙環(huán)[8,8,8]二十六烷，是典型的相轉(zhuǎn)移催化劑[1]，廣泛應(yīng)用于[18F]標(biāo)記放射性藥物的制備，能增強[18F]的親核性[2]，提高標(biāo)記產(chǎn)率。

目前，[18F]2-氟代脫氧-D-葡糖([18F]FDG)是使用最多的 PET(正電子斷層掃描)氟標(biāo)記的示蹤劑，其他[18F]標(biāo)記藥物也已大量應(yīng)用于臨床研究[3]。鑒于 K-222是高毒性物質(zhì)，美國藥典(USP-34)明確要求，使用[18F]FDG前須對K-222的殘留量進行薄層色譜(TLC)檢測[4]，其殘留量須低于 50 μg/mL。

[18F]的半衰期為110 min，為提高示蹤劑的利用效率，K-222的檢測方法要求快速、靈敏、穩(wěn)定、可靠。本研究用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法來檢測[18F]FDG中的K-222殘留濃度。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

K-222對照品(Sigma-aldrich，含量98%)；阿奇霉素對照品(內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所，946 U·mg–1)；乙腈，色譜純，德國默克公司；乙酸銨，質(zhì)譜純，美國Sigma公司；水為重蒸去離子水。

Shimadzu 20A高效液相色譜儀系統(tǒng)(日本島津公司)；API 4000 QTrap串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX公司)；Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理工作站。數(shù)字脈沖旋渦混合儀(美國Glas-Col公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：ultimate XB C18(Φ4.6 mm × 150 mm，填料顆粒直徑 3 μm；流動相：乙腈和 40 mmol/L NH4Ac (50:50)，流速0.85 mL/min，通過調(diào)節(jié)PEEK管的長度使其中1/3進入離子源，其余的流入廢液瓶；柱溫：室溫；進樣體積：10 μL。

離子源為電噴霧離子源(ESI源)，正離子方式檢測，用于定量分析的離子對 K-222為m/z377.3–114.2 (裂解能量(CE)為 45 V)。內(nèi)標(biāo)為m/z749.9–158.4 (CE為55 V)，解簇電壓(DP)值為100 V，掃描時間為200 ms，入口電壓(EP)為9 V，出口電壓(CXP)為7 V，氣簾氣(CUR)為137.9 kPa (高純氮)，碰撞氣(CAD)為中度，源電壓(IS)為 5500 V，源溫度(TEM)為 500oC，霧化氣(GS1)為 413.7 kPa (高純氮)，加熱輔助氣(GS2)為482.65 kPa (高純氮)。

1.2.2 儲備液及工作溶液配制

精確稱取 K-222 10 mg，配成濃度為 1 mg·mL–1的 K-222 儲備液；取 10 μL 儲備液，配成 10 μg·mL–1的工作液I。

精確稱取阿奇霉素(內(nèi)標(biāo))10 mg，配成濃度為1 mg·mL–1的阿奇霉素儲備液；將儲備液用 50%乙腈水溶液稀釋成濃度為0.03 μg·mL–1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.3 示蹤劑[18F]FDG的制備及樣品的處理

從德國西門子RDS-111回旋加速器出質(zhì)子轟擊富氧水，由18O(p,n)18F反應(yīng)得[18F]負(fù)離子，被經(jīng)預(yù)活化的負(fù)離子交換樹脂(QMA)捕獲，再經(jīng)含K2CO3和Kryptofix 2.2.2的乙腈溶液洗脫后進入反應(yīng)管，蒸發(fā)除水后與前體1,3,4,6-四-O-乙?；?2-O-三氟甲磺酸基-β-D-甘露糖進行親核取代反應(yīng)，加入鹽酸水解后得到粗產(chǎn)品[18F]FDG，粗產(chǎn)品經(jīng)純化、無菌過濾后得到臨床用藥。

直接取制備得到的[18F]FDG水溶液10 μL或按一定比例稀釋后進樣10 μL。稀釋液(空白液)為制備[18F]FDG過程中不加入K-222得到的水溶液。

1.2.4 方法的專一性試驗和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

空白溶液進樣 10 μL，獲得空白液樣品色譜圖。以 10 μg·mL–1的 K-222 工作液 I用空白液配成濃度為 120 ng·mL–1的 K-222樣品，各加入內(nèi)標(biāo)工作液，以空白液逐步稀釋成濃度分別為120、60、20、5、1、0.5 ng·mL–1，而內(nèi)標(biāo)濃度為 15 ng·mL–1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各進樣10 μL。以K-222峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(y)為縱坐標(biāo)，以 K-222濃度(x)為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 方法回收率及精密度

分別配制低(LQC，1 ng·mL–1)、中(MQC，10 ng·mL–1)、高(HQC，100 ng·mL–1)濃度的 K-222 溶液質(zhì)控樣品各15份，分3批，每批5份，各取10 μL進樣，計算質(zhì)控樣品的檢測濃度，求得回收率和精密度，以及K-222低、中、高濃度的質(zhì)控樣品批內(nèi)RSD和批間RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性和稀釋因子考察

考察K-222低、中、高濃度的質(zhì)控溶液樣品，以及室溫和4oC下放置24 h后的穩(wěn)定性。每個濃度5份樣品，穩(wěn)定性=(測定值/加入值)×100%。

配制濃度為 1、10、200 μg·mL–1的 K-222 質(zhì)控溶液各 5 份，將 1、10 μg·mL–1的用空白液稀釋 100倍，將 200 μg·mL–1的用空白液稀釋 2000倍，考察稀釋后質(zhì)控的準(zhǔn)確性。

1.2.7 基質(zhì)效應(yīng)考察

用2種條件下信號峰面積的平均值考察基質(zhì)效應(yīng)。Set1：對照品用流動相配成低、中、高濃度樣品，Set2：將空白液用樣品處理方法得到的上清液來配成低、中、高濃度樣品，則基質(zhì)效應(yīng)(ME)=Set2/Set1，K-222 采用低(1 ng·mL–1)、中(10 ng·mL–1)、高(100 ng·mL–1)濃度點，內(nèi)標(biāo)采用一個濃度點(15 ng·mL–1)，各條件下重復(fù)測定 5個樣品。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

分別進樣空白液樣品的色譜圖見圖1。

圖1 空白液色譜圖Fig.1 Chromatograms of the blank solution.

空白液加入含一定濃度內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得的色譜見圖2；由圖1圖2，K-222、內(nèi)標(biāo)的出峰時間分別為3.48 min和2.53 min。

取[18F]FDG溶液樣品，依同法操作，得色譜見圖3。結(jié)果表明，空白液中內(nèi)源性物質(zhì)并不干擾K-222及內(nèi)標(biāo)的測定。

圖2 空白液中加入 K-222 標(biāo)準(zhǔn)品(50 ng·mL–1)和內(nèi)標(biāo)(15 ng·mL–1)的色譜Fig.2 Chromatograms of the blank solutions spiked with K-222 (50 ng·mL–1) and internal standard (15 ng·mL–1)

圖3 [18F]FDG樣品溶液的色譜圖3 Chromatograms of a sample taken from reaction solutions.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

K-222 濃度在 0.5–120 ng·mL–1呈良好線性關(guān)系，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性(r)均好于 0.99。濃度為120、60、20、5、1、0.5 ng·mL–1的標(biāo)準(zhǔn)溶液各進樣 10 μL，獲得代表性標(biāo)準(zhǔn)方程：y=0.508x+0.00244 (r=0.9959，權(quán)重系數(shù)為1/x2)。最低檢測限為 0.5 ng·mL–1(信噪比 S/N≥9)。

2.3 方法回收率及精密度

由表1，K-222低、中、高濃度的質(zhì)控樣品批內(nèi) RSD在 5.2%–7.8%，批間 RSD介于5.4%–8.4%，方法回收率介于101.3%–106.6%。

表1 LC-MS/MS檢測K-222的穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)、精密性和準(zhǔn)確性Table 1 The stability, matrix effect, precision and accuracy of K-222 using LC-MS/MS method.

2.4 穩(wěn)定性和稀釋因子考察

由表1，K-222低、中、高濃度的質(zhì)控樣品置于室溫 24 h后的穩(wěn)定性分別為 98.7%、101.6%、106%，樣品于 4oC放置 24 h后的穩(wěn)定性分別為99.7%、102%、107%。說明K-222在常溫和較低溫度下是穩(wěn)定的。稀釋后的準(zhǔn)確性分別為(108.2±7.6)%、(94.4±5.7)%、(105.2±8.5)%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

由表1，低、中、高濃度的 K-222和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)分別為 100.9%、103.3%、104.0%和97.1%，可見空白液基質(zhì)對低、中、高濃度藥物的測定影響程度基本一致。

2.6 常規(guī)5批次[18F]FDG檢測結(jié)果

隨機取5批次的[18F]FDG用空白液稀釋100倍后取 10 μL進樣，結(jié)果列于表2。日常生產(chǎn)的[18F]FDG中K-222的殘留量均符合USP的要求，其值均低于 50 μg·mL–1。

表2 常規(guī)[18F]FDG中K-222的檢測結(jié)果(n=3)Table 2 The level in routine [18F]FDG.

3 討論

目前，K-222的檢測方法很多，如薄層色譜法[5](TLC，最低檢測限為 2 μg·mL–1)、氣相色譜法[6](GC，最低檢測限為 0.25 μg·mL–1)、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[7](HPLC-MS，最低檢測限為 1 ng·mL–1)等，但都具有檢測限低、低靈敏度、重現(xiàn)性不好、操作繁瑣、樣品使用量大、有專用的檢測器、分析時間長、誤差大等缺點。對于短半衰期的放射性藥物而言，浪費了藥物的使用效率，直接造成經(jīng)濟損失，且使操作人員接受的輻射量大大增加。

與文獻[7]報道檢測K-222的方法相比，本研究的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬、靈敏度高、檢測限低(0.5 ng·mL–1)、分析時間短，可在 4 min內(nèi)完成 K-222的定量檢測，特別適合短半衰期示蹤劑藥物中K-222殘留量的檢測。

K-222母離子經(jīng)二級質(zhì)譜打碎后會形成較多碎片，經(jīng)比較，選取穩(wěn)定性最好的m/z114.2的碎片離子與母離子(m/z377.3)組成離子對進行定量分析。

實驗所用LC-MS/MS方法主要應(yīng)用于[18F]標(biāo)記的示蹤劑中K-222殘留量的測定，每次進樣前在相同條件下進標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定的結(jié)果值如果在規(guī)定范圍之內(nèi)(即低于 50 μg·mL–1)，該批次的藥物可用于PET顯像。

實驗中每批需隨行做兩支空白管，標(biāo)準(zhǔn)曲線，6支質(zhì)控(低、中、高濃度各 2支)，如所測樣品濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，則用空白將該樣品按一定比例稀釋，得到結(jié)果再乘以稀釋倍數(shù)即可。

4 結(jié)語

研究結(jié)果表明，HPLC-MS/MS方法具有快速、簡便、靈敏、穩(wěn)定性好、線性范圍寬等優(yōu)點，適合測定短半衰期[18F]標(biāo)記的示蹤劑中K-222殘留量的檢測。

1 唐剛?cè)A. 短半衰期正電子發(fā)射放射性藥物合成方法學(xué)及進展[J]. 核技術(shù), 2003, 26(7): 551–555 TANG Ganghua. Synthetic methodology of short half-life radiopharmaceuticals for PET. Nucl Tech, 2003, 26(7):551–555

2 何山震, 王淑俠, 王朋, 等. 單管法酸水解合成[18F]FDG中反應(yīng)條件的探討[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版), 2009, 30(3S): 61–63 HE Shanzhen, WANG Shuxia, WANG Peng,et al. Study of influence factors on preparing [18F]FDG by hydrolyzing with HCl in single vessel [J]. Journal of Sun Yat-sen University (Medical Sciences), 2009, 30(3S):61–63

3 Peter J H, Scott, Michael R, Kilbourn. Determination of residual Kryptofix 222 level in [18F]-labeled radiopharmaceuticals for human use. Applied Radiation and Isotopes, 2007, 65: 1359–1362

4 USP 32-NF 27, 《823》Radiopharmaceuticals for positron emission tomography—compounding, Official Monographs, 2010: 933–934

5 Nakao R, Ito T, Yamaquchi M,et al. Simultaneous analysis of FDG, ClDG and Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG preparation by high-performance liquid chromatography with UV detection[J]. Nucl Med Biol, 2008, 35(2):239–244

6 Ferrieri R A, Schlyer D J, Alexoff D L,et al. Detect analysis of Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG by GC using a nitrogen-selective detector. Appl Radiat Isot, 1993, 57:697–703

7 Ying Ma, Bill X. Huang, Michael A,et al. Quantification of Kryptofix 2.2.2 in 2-[18F]FDG and other radiopharmaceuticals by LC/MS/MS [J]. Nuclear Medicine and Biology, 2002, 29(01): 125–129