李欣燃，唐旭東，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319；2.深圳清華大學(xué)研究院深圳市創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點實驗室）

目前，由于抗生素藥物長期反復(fù)使用和濫用，臨床上出現(xiàn)了超強耐藥、多重耐藥的病原體菌株，一些比較常見的菌體，如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）等在臨床上都出現(xiàn)了大量的耐藥菌株，嚴重威脅著患者的身體健康和生命安全。因此，對病原菌耐藥性的研究已成為當(dāng)今一個熱點，對耐藥性病原體感染的預(yù)防和治療也成為臨床上亟待解決的一個問題。許多研究表明，病原菌形成生物被膜（Biofilm）是病原菌耐藥的一個重要原因之一。

生物被膜，是指由微生物在接觸表面粘附、生長而形成的菌體立體復(fù)雜群落，同時所形成的生物被膜中所包含的細胞外基質(zhì)將分泌這些胞外基質(zhì)的菌體包含其中[1]。這種復(fù)雜群落是微生物為了適應(yīng)周圍環(huán)境而形成相對于分散浮游態(tài)細胞而存在的一種獨特形式。一方面，生物被膜可以保護在膜內(nèi)的菌體不受抗生素等藥物作用和人體免疫系統(tǒng)的攻擊，另一方面，由生物被膜內(nèi)釋放出來的增殖菌體還會引起慢性感染和反復(fù)感染[2]。利用傳統(tǒng)的抗生素難以將生物被膜完全清除，同時還會造成形成生物被膜相關(guān)菌體的耐藥性。因此，開發(fā)對細菌和真菌生物被膜有抑制作用的抗菌劑在臨床上具有重大意義。

白花丹素（Plumbagin，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），是廣泛分布于我國華南地區(qū)的常見植物白花丹的主要活性成分，對其的開發(fā)利用早已有所報道，而主要集中在其所具有的抗腫瘤作用[3-5]，同時其還具有降低血脂作用[6]、抗寄生蟲作用[7]、殺蟲作用[8]，抗細菌和真菌作用也有所報道[9]，但對病原菌生物被膜活性作用研究尚未見報道。

圖1 白花丹素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of plumbagin

因此，研究先采用微量稀釋法分別考察白花丹素對S.aureus、E.coli和C.albicans的作用效果，再利用96孔微量滴定板分別建立上述三種病原菌的生物被膜模型，最后通過平板計數(shù)法檢測白花丹素對細菌以及真菌所形成生物被膜的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及保存

菌株：S.aureus ATCC 29213、E.coil ATCC 25922和C.albicans ATCC 10231購于美國典型菌種保藏中心 （American Type Culture Collection，ATCC）。S.aureus ATCC 29213和E.coil ATCC 25922在米勒-希爾頓瓊脂培養(yǎng)基（Muller-Hinton Broth Agar，MHA）中劃板活化，然后在37℃條件下培養(yǎng)24～48 h后，放置于4℃保存?zhèn)溆茫籆.albicans ATCC 10231則用沙堡氏葡萄糖培養(yǎng)基（Sabouraud Dextrose Agar，SDA）劃板活化，37℃條件下培養(yǎng)24～48 h后，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 藥品及化學(xué)試劑

白花丹素購于中國藥品生物制品檢定所；白花丹素以二甲基亞砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）為母液配置成最終濃度為40 960μg·mL-1的藥品實驗用母液，密封保存于-20℃。MHA、MHB、SDA、SDB和96孔微量滴定板均購買于生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白花丹素對S.aureus ATCC 29213懸浮菌的MIC和MBC測定

依據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會M27-A標(biāo)準(zhǔn)，利用改良后的肉湯稀釋法來檢測白花丹素對S.aureus ATCC 29213懸浮菌的MIC和MBC。從保存于4℃的S.aureus ATCC 29213瓊脂板菌株中挑取單菌落，接種于MHB培養(yǎng)基中，37℃震蕩過夜培養(yǎng)。用MHB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，分光光度計測量時使其OD600值為0.4（～5×108 cfu·mL-1），并稀釋到1×106 cfu·mL-1。用MHB培養(yǎng)基稀釋藥液，使藥液終濃度為1 024μg·mL-1。在無菌96孔微量滴定板的每排第一孔中加入200μL終濃度為1 024μg·mL-1的藥液，在第2孔到第10孔中加入100μLMHB培養(yǎng)基。在每排中，用100μL移液器從每排第一孔中移出100μL液體加入到各自排的第2孔中進行稀釋混勻，然后向后依次進行稀釋混勻，直到每排的第10孔，每稀釋混勻一孔換一次槍頭。在每排第11孔中加入200μLMHB培養(yǎng)基作為陰性對照，在每排第12孔中加入100μLMHB培養(yǎng)基和100μL稀釋好的菌液作為正常生長對照孔。再在每排第1到第10孔中每孔加入100μL調(diào)好的稀釋菌液。這樣每排第1孔到第10孔中藥液濃度分別為：512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg·mL-1，各孔中DMSO含量均小于1%[10]。將96孔微量滴定板放置在37℃溫箱內(nèi)孵育24 h。每個檢測平行做3次，以視覺法判斷最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），以96孔微量滴定板底部清亮孔為準(zhǔn)，該孔中對應(yīng)藥物濃度為MIC。從MIC終點孔到第10孔中分別吸取10μL液體接種于MHA平板上，37℃溫箱中孵育24 h。觀察結(jié)果，接種平板中未見菌體生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。

1.2.2 白花丹素對S.aureus ATCC 29213生物被膜的MIC和MBC測定

從保存的S.aureus ATCC 29213 MHA瓊脂板菌株中挑取單菌落，接種于MHB培養(yǎng)基中，37℃震蕩過夜培養(yǎng)。用MHB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，分光光度計測量時使其OD600值為0.4（～5×108 cfu·mL-1），并稀釋到1×105 cfu·mL-1。在無菌96孔微量滴定板中的每孔中加入200μL調(diào)好的菌液。將96孔板放置在37℃溫箱內(nèi)孵育48 h。使96孔板底部出現(xiàn)明顯的生物被膜結(jié)構(gòu)。小心吸棄孔中200μL液體，再向每孔中加入250μL PBS，并吸棄，如此洗膜3次。操作過程中注意不要破壞生物被膜結(jié)構(gòu)。在無菌離心管中用MHB對藥物以初始濃度為2 048μg·mL-1進行兩倍濃度的連續(xù)稀釋，并按順序在相應(yīng)孔中加入相應(yīng)濃度稀釋好的藥物溶液200μL，每排第12孔中加入200μLMHB培養(yǎng)基作為正常生長對照孔。37℃溫箱內(nèi)孵育24 h。再吸棄孔中液體，用PBS按上述方法清洗一次，再加入200μL PBS，重懸后均勻混合，取10μL接種于MHA平板上，再在37℃溫箱內(nèi)放置24 h。該實驗同樣也平行做3次。觀察結(jié)果，與正常生長對照孔比較，菌體生長情況相等或最先受到抑制的平板對應(yīng)的孔中藥物濃度為MIC，以接種平板中未見菌體生長的最低藥物濃度為MBC。

1.2.3 白花丹素對E.coil ATCC 25922懸浮菌的MIC和MBC測定

測定方法與1.2.1中的測定方法相同。

1.2.4 白花丹素對E.coil ATCC 25922生物被膜的MIC和MBC測定

測定方法與1.2.2中的測定方法相同。

1.2.5 白花丹素對C.albicans ATCC 10231懸浮菌MIC和MBC測定

首先從保存C.albicans ATCC 10231的瓊脂板菌株中挑取單菌落，接種于SDB中，37℃震蕩培養(yǎng)16 h。用SDB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，用分光光度計測量時使其OD600值為1（～3×107 cfu·mL-1），并稀釋到106cfu·mL-1。用SDB稀釋藥液，使藥液終濃度為1 024μg·mL-1。取無菌96孔微量滴定板，在每排第1孔中加入200μL終濃度為1 024μg·mL-1的藥液，在第2孔到第10孔中分別加入100μL SDB培養(yǎng)基。調(diào)藥及加菌液濃度方法同1.2.1。

1.2.6 白花丹素對C.albicans ATCC 10231生物被膜菌MIC和MBC測定

菌液濃度調(diào)整方法同上。實驗操作方法同1.2.2，所不同之處在于被膜孵化溫度和平板中菌體生長溫度均為30℃。MIC和MBC終點判讀方法同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 白花丹素對S.aureus ATCC 29213懸浮菌和生物被膜的M IC和MBC

如表1所示，白花丹素對S.aureus ATCC 29213懸浮菌的MIC和MBC分別為4μg·mL-1，32μg·mL-1；對S.aureus ATCC 29213生物被膜的MIC和MBC分別為32μg·mL-1和128μg·mL-1。從結(jié)果可知，白花丹素對S.aureus ATCC 29213的懸浮態(tài)具有明顯的抑菌效果，而對生物被膜態(tài)菌的抑制效果較弱。

表1 白花丹素抗S.aureus ATCC 29213活性檢測結(jié)果Table1 The results of plumbagin against S.aureus ATCC 29213

2.2 白花丹素對E.coil ATCC 25922懸浮菌和生物被膜的M IC和MBC

結(jié)果如表2所示，白花丹素對E.coil ATCC 25922懸浮菌的MIC和MBC分別為32μg·mL-1，64μg·mL-1；對E.coil ATCC 25922生物被膜的MIC和MBC分別為64μg·mL-1和>2 048μg·mL-1。從結(jié)果可知，白花丹素對E.coil ATCC 25922的懸浮態(tài)及形成生物被膜后同樣有較明顯的抑菌效果。

2.3 白花丹素對C.albicans ATCC 10231懸浮菌和生物被膜的M IC和MBC

白花丹素對C.albicans ATCC 10231懸浮菌的MIC和MBC分別為4μg·mL-1和8μg·mL-1；而對生物被膜菌的MIC和MBC分別為64μg·mL-1和>2 048μg·mL-1，結(jié)果如表3所示。這說明白花丹素對白色念珠菌也有較好的抗性。

表2 白花丹素抗E.coil ATCC 25922活性檢測結(jié)果Table2 The results of plumbagin against E.coil ATCC 25922

表3 白花丹素抗C.albicans ATCC 10231活性檢測結(jié)果Table3 The results of plumbagin against C.albicans ATCC 10231

3 討論

自從1933年Arthur T.Henrici首次報道了細菌在水環(huán)境中形成生物被膜的現(xiàn)象以來[11]，生物被膜的嚴重危害及其形成過程已被研究者所熟知，并且隨著分子生物學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認識到引起疾病的病原菌不只是以懸浮狀態(tài)存在，同時還以生物被膜的形式存在，不僅如此，生物被膜態(tài)的菌體還可能是病原菌引起疾病的主要形式。而要清除生物被膜態(tài)存在的病原菌所需要的抗生素的用量往往對人體具有不能承受的毒性。由實驗結(jié)果也直接說明，白花丹素對金黃色葡萄球菌生物被膜菌的MIC值是對其懸浮菌MIC值的32倍；對白色念珠菌來說，白花丹素對生物被膜菌的MIC值是對懸浮菌MIC值的16倍；只有大腸桿菌，白花丹素對其生物被膜菌的MIC值僅是對懸浮菌MIC值的2倍。這也說明治愈由生物被膜引起的感染需藥量要大大增加。

目前對于聯(lián)合用西藥來抑制清除菌體生物被膜的研究成為熱點，雖有效果但效果都不是很顯著[12]，同時還不利于藥物耐藥性的控制。因此，從藥物毒性小、無耐藥性而且來源豐富的天然藥物中尋找清除生物被膜的有效成分成為治療或輔助治療生物被膜相關(guān)疾病的有效的新途徑。

對于生物被膜的研究目前已經(jīng)成為一個熱點，一方面集中在生物被膜的特性以及生物被膜本身形成過程及其分子機制的研究上，另一方面集中在了解生物被膜的危害以及尋找抑制清除生物被膜有效藥物的研究上。如Ramage的研究小組研究發(fā)現(xiàn)[13]，適當(dāng)濃度的法尼醇可以阻抑白色念珠菌生物被膜的形成，同時他們還分別從mRNA水平和蛋白水平考察了法尼醇對白色念珠菌hwp1基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)法尼醇可以有效降低該基因的表達。本試驗就是從后一個角度出發(fā)，利用天然藥用植物白花丹中的主要有效成分白花丹素作用于細菌和真菌的生物被膜，以檢測其對細菌和真菌生物被膜作用活性，而且可以結(jié)合第一個方面，對白花丹素抑制細菌、真菌生物被膜作用的分子機制可做進一步研究。因為生物被膜的形成是菌體的積聚，因此，生物被膜隨著時間的推移應(yīng)該呈現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性，所以，藥物對其的作用不僅僅應(yīng)該考慮藥物濃度的不同，同時還應(yīng)該考慮生物被膜形成時間和藥物作用時間。

目前對于藥物對生物被膜的作用主要集中于體外研究，這就忽略了體內(nèi)藥物作用的諸多因素，比如藥物進入人體后作用濃度會發(fā)生改變等因素，因此，對于藥物作用于生物被膜的研究要應(yīng)用于臨床，就要進行體內(nèi)研究。

總之，白花丹素具有抗細菌和真菌活性，不僅如此，白花丹素在一定濃度下還具有明顯的抑制細菌和真菌生物被膜的活性。因此可以說，試驗為進一步防治生物被膜感染提供了一條安全有效的用藥新思路，在臨床上具有較大的開發(fā)利用價值。研究還可進一步深入，一方面我們可以對白花丹素抑制生物被膜形成的作用機制進行研究，另一方面我們還可以檢測白花丹素在體內(nèi)對生物被膜作用效果，同時還可以考慮將其作為增效劑來增加病原菌相對藥物的藥效和減少相對藥物的用量。

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