劉芳，黃立楠

（大慶油田農場，大慶163458）

花粉管通道法（pollen tube pathway）是由我國科學家周光宇首先提出和設計的[1-4]。20世紀70年代以來，花粉管通道法在改良玉米、水稻、小麥、大豆和棉花等多種作物的高產(chǎn)、優(yōu)質及抗性等方面得到了廣泛的應用，大量試驗結果表明，外源DNA 通過該途徑導入受體后，不僅出現(xiàn)廣泛變異，并在一些作物中已選育到優(yōu)良的穩(wěn)定遺傳新品系[5]。然而花粉管通道法轉化技術的關鍵在于花粉管通道的導入路徑，本文將選用一種新的試驗方法，即通過GeneFinderTM核酸染料對外源DNA 導入路徑進行觀察和分析。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

供體：高粱（吉甜粱2 號系）；受體：玉米（Zea mays L.）優(yōu)良自交系4112。供試材料高粱和玉米分別由吉林省農業(yè)科學院作物育種研究所和玉米所提供。

熒光染料為核酸染料GeneFinderTM（百維信生物科技有限公司，廈門，中國），該染料屬于花青類染料，毒性很低，使用安全，可有效保護實驗操作者和環(huán)境。GeneFinderTM與dsDNA 結合熒光信號可增強800～1 000 倍，其檢測核酸的靈敏度比EB 染色法平均高10 倍左右，具有安全、靈敏、經(jīng)濟的特點，在紫外透射光下雙鏈DNA 與該染料結合呈現(xiàn)綠色熒光。

1.2 花粉管通道導入外源總DNA 技術

采用CTAB 法提取供體材料的總DNA[6]，供體高粱用于外源DNA 導入工作的溶液濃度為10 ng ·mL-1。

隨機選取一株自交授粉后24 小時的玉米果穗，平齊剪去距穗軸頂部1 cm 以上的苞葉和花絲，將其分成兩份，將混有熒光染料（GeneFinderTM）供體高粱的總DNA 溶液滴在一份剪齊的花絲上，每穗滴0.5 mL。分別于8、22 h 采摘若干花絲與未加入染料的授粉花絲（CK）通過紫外成像儀進行對比試驗。

2 結果與分析

2.1 外源DNA 導入8 h 后對導入路徑觀察

從圖1 可以看出，未進行外源DNA 導入的花絲通過紫外成像儀可觀察到，花絲整體灰暗且分布均勻一致，說明花粉蛋白要與柱頭蛋白已經(jīng)相互識別，經(jīng)過一段時間后，將會萌發(fā)出花粉管，當授粉8 h 后玉米花絲已形成花粉管通道，但卻無外源DNA 導入，因此花絲較暗；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花絲在接近滴入口1～3 cm 處的位置有亮點出現(xiàn)，說明外源導入8 h 后含有GeneFinderTM 外源DNA 已經(jīng)滲入到了花粉管通道中，此時正從滴入口沿花粉管通道向胚囊方向運行。由于玉米授粉后花絲個體之間的差異，外源DNA 導入后并非所有花絲滴入口均能呈現(xiàn)亮點，因此圖中2 號花絲通過外源DNA 導入技術后整體花絲仍較暗，說明2 號花絲沒有成功導入外源DNA。

圖1 外源導入8 h 后的花絲對比結果Fig.1 Contrast result of filament after 8 h outside introduction

2.2 外源DNA 導入22 h 后對導入路徑觀察

從圖2 可以看出，未進行外源DNA 導入的花絲通過紫外成像儀觀察仍呈現(xiàn)整體灰暗的現(xiàn)象，說明沒有外源DNA 導入的花絲在授粉后的任何時期內在亮度上都不會發(fā)生太大的變化；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花絲，從整體上看亮度幾乎分布均勻一致（3 號花絲因外力碾壓，所以花絲表面部分萎蔫），說明授粉22 h 后含有GeneFinderTM外源DNA 正沿花粉管通道向胚囊方向運行了很長距離。

圖2 外源導入22h 后的花絲對比結果Fig.2 Contrasting result of filament after 22 h outside introduction

3 討論與結論

3.1 花粉管通道形成的過程

在溫度為25～30℃以及相對濕度為85%以上的情況下，玉米花粉落到花絲上10 min 以后就開始發(fā)芽，30 min 左右大量發(fā)芽[7]。花粉水合，進而釋放花粉蛋白與柱頭蛋白相互識別，親和的花粉便可以萌發(fā)產(chǎn)生花粉管?；ǚ酃芡ㄟ^花柱而達子房的生長途徑可分為兩種不同的情況：一些植物的花柱中間成空心的花柱道，花粉管在生長時沿著花柱道表面下伸，到達子房；另一種情況是花柱并無花柱道，而為特殊的引導組織或一般薄壁細胞所充塞，花粉管生長時需經(jīng)過酶的作用，將引導組織或薄壁組織細胞的中層果膠質溶解，花粉管經(jīng)由細胞之間通過?；ǚ酃艿竭_子房以后，在子房壁內表皮和胎座的表面生長，遇到珠柄后，沿珠柄轉向胚珠表面生長，到達珠孔處，花粉管經(jīng)珠孔進入胚囊[8]。

目前在花粉管通道導入技術成敗的關鍵因素中，最主要的是外源DNA 的導入路徑和導入后的整合問題，而花粉管是連接柱頭與胚囊之間唯一的結構，又因其栓塞結構的存在，使得花粉管成為一個不連續(xù)的系統(tǒng)，所以它不可能運轉外源DNA，而花粉管的外表面則可成為溶液物質轉移的唯一連續(xù)界面，此時外源DNA 溶液就會沿著連接柱頭與胚囊的花粉管外界面滲入胚囊。從某種意義上來講，外源DNA溶液的導入部位離胚囊越近，越有利于外源DNA 的滲入，為此花粉管必須先形成，而后才能導入外源DNA。但事實上，由于玉米授粉后花絲個體之間的差異，該導入技術并非使玉米的全部花絲均能成功導入外源DNA，因此，只能說在嚴格規(guī)定導入時間及技術手段的前提下，外源DNA 導入技術能成功導入絕大部分玉米花絲。

3.2 花粉管通道導入路徑的研究進展

龔蓁蓁等[9]將花粉管通道的轉化機理歸結為棉花受精時所形成的自珠孔到胚囊之間的花粉管通道，外源DNA 由此通道進入胚囊。鄧德旺等[10]認為，外源DNA 導入的途徑為花粉管外通道，經(jīng)胎座上部傳輸組織束中的花粉管外縫隙胎座表面、珠孔、珠心通道進入胚囊。曾君祉等[11]認為，外源DNA 引入運行的花粉管內，使之有機會參與受精過程，達到轉化的目的。花粉管生長途徑的有關組織結構的研究結果表明，通過花粉管的生長可以產(chǎn)生所謂的花粉管通道。

3.3 結論

本文運用一種新的試驗方法，通過熒光染料與dsDNA 結合在紫外成像儀下呈現(xiàn)綠色熒光的特點，來觀察授粉后不同時期外源DNA 在花絲內通過路徑的變化。以授粉的玉米花絲為對照，外源導入8 h后外源DNA 從滴入口方向開始向胚囊方向運行，而外源導入22 h 后整個花絲都呈現(xiàn)亮度整體一致的現(xiàn)象，說明此時外源DNA 已向胚囊方向運行了很長一段距離，經(jīng)過一段時間后，可能到達子房，這與劉金元等[12]的試驗結論一致。

［1］ 周光宇.從生物化學的角度探討遠緣雜交的理論［J］.中國農業(yè)科學，1978（2）:16-20.

［2］ 周光宇.遠緣雜交的分子基礎—DNA 片段雜交假說的一個論證［J］.遺傳學報，1979，6（4）:405-412.

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［7］ 顏啟傳.種子學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2001.

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［12］ 劉金元.利用顯微放射自顯影技術檢測外源DNA 導入玉米的研究［J］.核農學通報，1994，15（2）:70-72.