何灝彥

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工系，湖南 株洲412004）

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物，是一種天然的陽(yáng)離子型直鏈氨基生物多糖。殼聚糖具有生物相容性，無(wú)毒，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，但通常分子量很大、只能溶于某些酸性溶液中，使得它的應(yīng)用受到很大的限制，甚至其某些特殊功能只有在降解成殼寡糖后才能表現(xiàn)出來(lái)。殼聚糖的降解方法主要包括化學(xué)法、物理法、酶解法[1］，其中，酶解法具有能耗低、原料價(jià)廉、環(huán)境污染小、反應(yīng)條件溫和、易控制、設(shè)備簡(jiǎn)單、產(chǎn)品生物活性高等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[2］。

殼聚糖酶是一種對(duì)線性殼聚糖具有分解作用的專一性酶，可以選擇性地、特異性地切斷殼聚糖的β－1，4－糖苷鍵，得到特定分子量范圍的殼寡糖[3］。作者在此以殼聚糖為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)卷枝毛霉產(chǎn)生殼聚糖酶，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

pH 值為7.2的 Tris－HCl緩沖溶液：50.0mL 0.1mol·L－1Tris＋44.7mL 0.1mol·L－1HCl。

DNS（3，5－二硝基水楊酸）試劑：3，5－二硝基水楊酸1%、苯酚0.2%、亞硫酸鈉0.05%、氫氧化鈉1%、酒石酸鉀鈉20%，貯存于棕色瓶中，一周后穩(wěn)定。

1.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯200g，去皮，切塊，煮沸0.5h后用紗布過(guò)濾，加20g葡萄糖、20g瓊脂，溶化后補(bǔ)水至1000mL，121℃滅菌20min。

葡萄糖－硫酸銨培養(yǎng)基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.5%，不同質(zhì)量（0.0g，0.2g，0.4g，0.6g，0.8g，1.0g）的脫乙酰度為99%的殼聚糖，自來(lái)水1000mL。分裝后，121℃滅菌20min。

1.3 卷枝毛霉的培養(yǎng)及殼聚糖酶的分離純化

在含一定濃度殼聚糖的葡萄糖－硫酸銨液體培養(yǎng)基中，將卷枝毛霉于一定溫度、一定pH值、一定轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)一定時(shí)間；將10L培養(yǎng)基通過(guò)砂芯漏斗過(guò)濾，得到菌絲體；將其置于研缽中，用玻璃粉研磨1h，然后用pH 值為7.2的20mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液稀釋；最后于2500×g離心20min，取上清，即得含有殼聚糖酶的粗酶液。

純化：將粗酶液離心（20 000×g），取200mL上清液，加入固體硫酸銨達(dá)到60%至飽和；再離心（20 000×g）15min，取上清液，加入固體硫酸銨達(dá)到80%至飽和；再離心，取沉淀溶解于5mmol·L－1醋酸鈉緩沖溶液（pH值5.3）中，并透析1次；然后上20mL二乙胺乙基纖維素柱，用pH值為5.5的醋酸鈉緩沖溶液以5～100mmol·L－1梯度洗脫，流速60mL·h－1，得到的酶稀釋液大約是50mmol·L－1的醋酸鈉，通過(guò)膠棉過(guò)濾濃縮到1mL；再用pH值為7.2的20mmol·L－1氯化三羥甲基甲烷緩沖溶液透析；然后上3mL二乙胺乙基纖維素柱，先用上述相同濃度的醋酸鈉緩沖溶液洗脫（流速12mL·h－1），再依次用40 mL氯化鈉溶液（0～0.3mol·L－1）、15mL 0.3mol·L－1氯化鈉溶液、30mL 0.45mol·L－1氯化鈉溶液梯度洗脫（洗脫劑均配有pH值為7.2的20 mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液），即得到純化的殼聚糖酶液。

1.4 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

在不同的殼聚糖濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速下對(duì)卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力進(jìn)行比較，以確定卷枝毛霉發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的最佳條件[4］。

1.5 殼聚糖酶活力的測(cè)定方法

首先，按DNS比色法，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得擬合回歸方程：y＝0.2604x－0.0441，相關(guān)系數(shù)R＝0.9953，表明葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

然后，用DNS法進(jìn)行酶活力測(cè)定（以蒸餾水的DNS反應(yīng)液為參照）：取殼聚糖酶液2mL，與2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的殼聚糖溶液混合，50℃下保溫30min；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH溶液調(diào)pH值大于8.0，將未被降解的殼聚糖沉淀出來(lái)，于3000r·min－1離心10min；取上清液1mL，用DNS法測(cè)定吸光度，再根據(jù)回歸方程計(jì)算還原糖濃度，表征培養(yǎng)液中酶的活力[5］。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖濃度對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響

固定培養(yǎng)溫度為35℃、培養(yǎng)基pH值為5、培養(yǎng)時(shí)間為80h、搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1，考察殼聚糖濃度對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 殼聚糖濃度對(duì)產(chǎn)酶能力的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on enzyme production capacity

由圖1可知，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力隨殼聚糖濃度的增大先升高后降低，在殼聚糖濃度為0.8g·L－1時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。這是因?yàn)椋瑲ぞ厶菨舛仍龃螅瑢?duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶的誘導(dǎo)作用相應(yīng)增強(qiáng)，起到了對(duì)卷枝毛霉的馴化作用，從而提高了卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力；當(dāng)殼聚糖濃度增大到一定程度后，由于溶液的粘度增大影響到培養(yǎng)液的溶氧效果，微生物代謝率降低，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力相應(yīng)下降；而且殼聚糖是一種抑菌物質(zhì)，濃度越高，對(duì)微生物的抑制作用越強(qiáng)，這也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[6］。因此，選擇最佳殼聚糖濃度為0.8g·L－1。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶能力有著雙重影響，一方面，升高溫度可以提高卷枝毛霉的產(chǎn)酶速率，但隨著溫度的升高，酶會(huì)逐漸地變性失活。固定殼聚糖濃度為0.8g·L－1、培養(yǎng)基pH值為5、培養(yǎng)時(shí)間為80h、搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1，考察培養(yǎng)溫度對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶能力的影響Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme production capacity

由圖2可知，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力隨著培養(yǎng)溫度的升高先升高后降低，在培養(yǎng)溫度為40℃時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。因此，選擇最佳培養(yǎng)溫度為40℃。

2.3 培養(yǎng)基pH值對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響

固定殼聚糖濃度為0.8g·L－1、培養(yǎng)溫度為40℃、培養(yǎng)時(shí)間為80h、搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1，考察培養(yǎng)基pH值對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)基pH值對(duì)產(chǎn)酶能力的影響Fig.3 Effect of pH value of culture medium on enzyme production capacity

由圖3可知，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力隨培養(yǎng)基pH值的增大先升高后降低，在培養(yǎng)基pH值為5.5時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。這是因?yàn)?，殼聚糖的溶解度與pH值有很大關(guān)系，殼聚糖只能在酸性溶液中溶解，在pH值為7.5時(shí)則完全不溶，即pH值過(guò)高時(shí)，卷枝毛霉很難利用沉淀的殼聚糖，其生長(zhǎng)及產(chǎn)酶都受到抑制；但pH值過(guò)低對(duì)卷枝毛霉的生長(zhǎng)不利，培養(yǎng)液的生物量低，導(dǎo)致酶活降低[7］。因此，選擇最佳培養(yǎng)基pH值為5.5。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響

固定殼聚糖濃度為0.8g·L－1、培養(yǎng)溫度為40℃、培養(yǎng)基pH值為5.5、搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶能力的影響Fig.4 Effect of culture time on enzyme production capacity

由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間為84h時(shí)，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力最高。因此，選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間為84h。

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響

固定殼聚糖濃度為0.8g·L－1、培養(yǎng)溫度為40℃、培養(yǎng)基pH值為5.5、培養(yǎng)時(shí)間為84h，考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)卷枝毛霉產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力隨搖床轉(zhuǎn)速的加快先升高后降低，在搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。這是因?yàn)?，搖床轉(zhuǎn)速能影響培養(yǎng)液的溶氧效果，從而影響卷枝毛霉的產(chǎn)酶能力，但過(guò)量的溶氧對(duì)菌株合成酶不利[8］。因此，選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為180r·min－1。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶能力的影響Fig.5 Effect of rotation speed on enzyme production capacity

3 結(jié)論

以殼聚糖為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)卷枝毛霉產(chǎn)殼聚糖酶的最佳條件為：誘導(dǎo)物殼聚糖濃度0.8g·L－1、培養(yǎng)溫度40℃、培養(yǎng)基pH值5.5、培養(yǎng)時(shí)間84h、搖床轉(zhuǎn)速180r·min－1。

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