趙靈希，郭仁杰，熊海容

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玉米芯中木聚糖提取方法的研究

趙靈希，郭仁杰，熊海容*

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

采用堿解玉米芯粉末后，玉米芯堿解液用30%(w：v）過氧化氫溶液脫色并且用10%（w：v）三氯乙酸溶液脫蛋白來提取木聚糖，收得率分別為24.4%。并用真菌DSM10635菌株產(chǎn)的木聚糖酶對(duì)以三種不同來源的木聚糖以及自提玉米芯木聚糖為底物測(cè)得的米氏常數(shù)進(jìn)行比較，還檢測(cè)比較了DSM 10635木聚糖酶以樺樹和自提木聚糖作為底物的最佳酶促反應(yīng)溫度。結(jié)果表明，從玉米芯自提木聚糖的Km值7.5303與燕麥木聚糖的Km值5.6044相近，樺樹和自提的木聚糖的最佳酶促反應(yīng)溫度也都在65-70℃左右，具有一定的取代性。方法簡(jiǎn)單，收得率較高的木聚糖提取方法對(duì)工業(yè)上大量生產(chǎn)具有重要的意義。

玉米芯；木聚糖；木聚糖酶產(chǎn)物

自然界中最廣泛的存在于硬木植物和其他一些植物（如禾本種，谷類和草本植物等）中的木聚糖即為半纖維素木聚糖[1]。通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的連接而形成的木聚糖、纖維素和木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)[2]，木聚糖在被子植物來源的硬木質(zhì)中，占植物細(xì)胞壁總量的15~30%[3]。木聚糖是一種通過β-1，4-糖苷鍵連接β-D-吡喃型木糖單元而構(gòu)成主鏈的異質(zhì)多糖。大部分木聚糖是異型多糖，主鏈或側(cè)鏈上帶有多種不同的取代基。常見的取代基有葡萄糖醛酸、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、α-L-阿拉伯呋喃醛酸、乙?；?、阿魏酰基和p-香豆?；鵞4、5]。經(jīng)酶水解可生產(chǎn)國際市場(chǎng)上急需的低聚木糖、木糖等療效食品[6、7]。木聚糖作為生產(chǎn)木聚糖和木糖的原料是十分重要而必須的，但實(shí)際上商品木聚糖十分昂貴，無法作為生產(chǎn)原料，這時(shí)就需要探討量足價(jià)廉的木聚糖的生產(chǎn)方法。此文通過堿解玉米芯這兩種容易獲得的原料而得到木聚糖，為后續(xù)酶解木聚糖得到木寡糖提供了基礎(chǔ)。

近來，木聚糖被看成是最重要的可再生資源之一，是因?yàn)樗鼘?duì)通過化學(xué)修飾反應(yīng)而得到的新生物多聚體材料以及功能聚合物有著重要的基礎(chǔ)作用[8、9]。木聚糖也因?yàn)槠渲泄δ芊肿拥亩鄻有缘膽?yīng)用潛力無限而被看好，木聚糖及其衍生物最有可能產(chǎn)生的重要的應(yīng)用便是藥物載體、傷口敷料以及造紙業(yè)中的添加劑[10]。另外，木聚糖在食品中可用作乳化劑及膳食纖維,具有促進(jìn)有絲分裂及免疫調(diào)節(jié)等功能[11、12]。

文中以玉米芯為原料，通過堿法抽提獲得木聚糖，由玉米芯所得的木聚糖經(jīng)過過氧化氫脫色，三氯乙酸脫蛋白，得到進(jìn)一步的純化，收得率較高，為后續(xù)用自提木聚糖酶解得到木寡糖提供了很好的原材料，簡(jiǎn)化了為木寡糖的提取而需要的的純化步驟。并且通過對(duì)不同來源的木聚糖的米氏常數(shù)比較以及最適酶促反應(yīng)溫度的對(duì)比，表明從玉米芯提取所獲得的木聚糖具有一定的取代性。這一研究在可再生半纖維素資源的開發(fā)利用中具有重要意義。

1　材料與方法

1.1 材料與試劑

原料： 玉米芯：河南，粉碎成直徑0.2mm及以下的顆粒。

菌種：嗜熱真菌DSM10635從德國微生物菌種保藏中心（www.dsmz.de）DSMZ購買。

木聚糖酶液：發(fā)酵液8000×離心10min除去沉淀，上清液為木聚糖酶液。

樺樹木聚糖（Sigma，X0502），山毛櫸木聚糖（Sigma，X4252），燕麥木聚糖（Sigma），鹽酸，3，5—二硝基水楊酸（DNS）溶液，乙酸，次氯酸鈉，氨水，氫氧化鈉，過氧化氫，三氯乙酸，乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備：

SB-10A粉碎機(jī) 速邦500g多功能粉碎機(jī)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 金壇市科興儀器廠；152型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器 金壇市科興儀器廠；FD-1D-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 從玉米芯中提取木聚糖

將玉米芯烘干后粉碎成0.2mm大小左右的顆粒，稱取40g玉米芯加入400ml蒸餾水，120℃高溫預(yù)處理30min，過濾取濾渣[19]，將濾渣烘干后，加入400ml 15%（w：v）的氫氧化鈉溶液，110℃高溫蒸煮30min，過濾取濾液，將濾液用30%（w：v）的氫氧化鈉做脫色處理，脫色后加入10%（w：v）的三氯乙酸溶液（10:1）脫蛋白，10000r/min 離心20min，取上清液，加入濃鹽酸調(diào)pH值至中性。加入三倍體積的無水乙醇溶液過夜醇沉，8000r/min離心20min得到沉淀即為粗提木聚糖，-20℃冷凍過夜后冷凍干燥得到較純的木聚糖 。玉米芯木聚糖收得率%=所得玉米芯木聚糖(g)/原始玉米芯質(zhì)量（g）×100%。

1.3.2 測(cè)不同來源的木聚糖和自提木聚糖的米氏常數(shù)

測(cè)試米氏常數(shù)的方法以燕麥木聚糖為例，其他木聚糖米氏常數(shù)的測(cè)定方法與其一樣（其中自提玉米芯木聚糖中使用的濃度是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）：

樣品測(cè)定：用移液器吸取1.8ml的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%的燕麥木聚糖-磷酸緩沖液，分別打入1支干凈的具塞試管，置于電控恒溫水箱中， 60℃恒溫下預(yù)熱兩分鐘，加入0.2ml粗酶液，充分混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，再加入3mlDNS，充分混合，置沸水中煮沸5分鐘，然后迅速用冷水將其冷卻至室溫，在540nm下以空白樣對(duì)照測(cè)定吸光值。每種濃度的燕麥木聚糖-磷酸緩沖液做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果取其平均值。

1.3.3 將sigma的樺樹木聚糖和自提玉米芯木聚糖作為底物檢測(cè)DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反應(yīng)溫度的確定試驗(yàn)

樣品測(cè)定：用移液器吸取1.8ml的0.5%樺樹和自提玉米芯木聚糖—磷酸緩沖液，分別打入1支干凈的具塞試管置于電控恒溫水箱中，加入0.2ml粗酶液充分混勻，分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘后，拿出再加入3mlDNS，充分混合，置沸水中煮沸5分鐘，然后迅速用冷水將其冷卻至室溫，在540nm下以空白樣對(duì)照測(cè)定吸光值。每種溫度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果取其平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1玉米芯提取木聚糖的收得率

40g玉米芯最后得到木聚糖的總量是9.77g，所以自提玉米芯木聚糖的收得率為24.4%，較高的收得率對(duì)以后工業(yè)上大量的獲得木聚糖有著重要的意義。

2.2不同來源和處理方法得到的木聚糖比較

未脫色未脫蛋白得到的自提玉米芯木聚糖顏色相對(duì)要深一些，而且后來在配制木聚糖溶液時(shí)，未經(jīng)任何處理的木聚糖基本不能完全溶解，在溶液中有細(xì)小的懸浮顆粒，而經(jīng)脫蛋白脫色后的可以完全溶解成乳白色的木聚糖溶液，和從sigma購買的樺樹木聚糖配制出來的溶液就外觀上看基本一致。由后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可知性質(zhì)上也是相似的，具有可替代性。

2.3木聚糖酶對(duì)四種不同木聚糖底物所得的Km

木聚糖酶對(duì)以燕麥木聚糖為底物測(cè)得的Km是5.6044，以山毛櫸木聚糖為底物測(cè)得的Km是4.1737，以樺樹木聚糖為底物測(cè)得的Km是3.6273，以自提玉米芯木聚糖為底物測(cè)得的Km是7.5302。可以看出自提玉米芯木聚糖米氏常數(shù)7.5312與燕麥木聚糖的5.6044比較相近。說明自提木聚糖雖然有雜質(zhì)，但是依然具有一定的取代性，對(duì)那些只是用來做酶的性質(zhì)比較的實(shí)驗(yàn)，可以用其替代需要購買的比較昂貴的木聚糖。

2.4試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)比用sigma的樺樹木聚糖和自提玉米芯木聚糖檢測(cè)DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反應(yīng)溫度的試驗(yàn)，見圖1。

圖1 以自提玉米芯木聚糖和sigma樺樹木聚糖為底物的DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反應(yīng)溫度圖

從圖1可以看出自提玉米芯木聚糖對(duì)于DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反應(yīng)溫度和樺樹木聚糖的是一致的，在65-70℃左右，而且兩條曲線的趨勢(shì)基本是一致的，更進(jìn)一步說明了自提木聚糖是具有可替代性的，可以替代昂貴的sigma樺樹木聚糖作為檢測(cè)木聚糖酶的基本性質(zhì)的木聚糖底物。

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Experimental Study on Production of Xylan from Corncob

ZHAO Ling-xi, GUO Ren-jie, XIONG Hai-rong

(College of Life Science,South-central University for Nationalities, Wuhan Hubei 430074, China)

In this study xylan was obtained from corncob by base-hydrolysis，30% hydrogenperoxide and 10% trichloroacetic acid and the extraction rate was 24.4%.Comparing with the Michaelis constant of the same xylanase produced by Thermomyces lanuginosus DSM10635，which separately used three different kinds of xylan and xylan extracted by us as substrates， Km 7.5303 of xylan extracted by us is similar with Km 5.6044 of oak xylan.Then comparing with the optimatemparature of DSM10635 xylanase which used brich xylan and the extacted-xylan as substrates，the optimal temperature was about 65-70℃.This induced that it can substitute for brich xylan.The method of extraction was simple and the high yield have the significance to the mass-produce of xylan in industry.

Corncob; Xylan; Xylanase Production

Q814

A

1009－5160(2012)03－0060－03

熊海容（1966-），男，博士，教授，研究方向：生物工藝學(xué).