劉夢俠, 王麗娟, 孔令怡, 劉洪軍, 吳志昊, 辛夢嬌, 張 偉, 尤 鋒

(1. 山東海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島 266003)

孔鰩(Raja porosa), 俗稱勞板魚、勞子, 隸屬于軟骨魚綱(Chondrichthyes)、鰩形目(Rajiformes)、鰩科(Rajidae)、鰩屬(Raja), 主要分布于我國的黃海和東海, 為冷溫性近海底棲魚類[1-2]。該魚無硬骨, 肉質(zhì)細嫩鮮美, 深受消費者青睞, 是一種重要的地方性經(jīng)濟魚類。近年來, 由于硬骨魚資源的衰減和對軟骨魚肉、軟骨、魚鰭需求量的增加, 全球?qū)浌囚~類的捕撈量急增[3], 我國的孔鰩資源也因受過度捕撈、海洋環(huán)境污染等因素影響, 導致其資源衰退[4]。遺傳多樣性是生物進化和環(huán)境適應的物質(zhì)基礎, 是種質(zhì)資源有效保護的前提。海洋生物的遺傳結(jié)構受到很多海洋因素和生物因素的影響[5], 了解遺傳結(jié)構可為物種的種質(zhì)資源檢測和恢復提供基本信息,對于魚類的可持續(xù)管理是十分重要的[6]。目前國內(nèi)外有關孔鰩的研究相對較少, 主要集中在攝食[7]、養(yǎng)殖與捕撈[4,8]、物種鑒定[9-10]、繁殖[11]及硫酸軟骨素提取[12]等。

線粒體 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有母系遺傳、結(jié)構簡單、進化速度快、幾乎不發(fā)生重組等特點[13], 其中細胞色素b基因(cytochromeb,cytb)由于研究背景清晰, 進化速度適中, 適合群體水平差異的檢驗, 經(jīng)常被用于遺傳多樣性研究, 在魚類種群結(jié)構的研究中發(fā)揮了積極作用。目前, 已經(jīng)利用cytb部分序列對多種軟骨魚類包括多種鯊魚和鰩科魚類進行了群體遺傳多樣性研究[14-19], 但有關孔鰩群體的研究報道尚未見到。

本文對 2009年和 2011年采自榮成灣的孔鰩群體進行cytb部分序列的測定, 分析了其群體遺傳多樣性水平, 并比較了兩個年度群體遺傳差異, 以期了解榮成灣孔鰩的群體遺傳結(jié)構、不同年度間的遺傳分化程度, 為孔鰩資源的開發(fā)利用和管理保護提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗用孔鰩為2009年2～11月、2011年2～8月間分別以底拖網(wǎng)方式采自榮成灣海域(122°37′29″～122°46′16″E, 37°20′38″～37°13′26″N), 各為 10尾(編號為 RCRP0901-10)和 44尾(編號為RCRP1101-44)。經(jīng)過形態(tài)鑒定以后, 取樣品背部肌肉置于–20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴增

取孔鰩肌肉組織約 30 mg, 使用海洋動物組織基因組提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)提取基因組 DNA, 操作步驟按照使用說明進行。參考GenBank上孔鰩線粒體全基因組序列(AY525783.1),設計一對引物cytbF: 5'-TCATCCGCAACATTCACGCCAAT-3',cytbR: 5'-GGCAAGTGGGAGAAGGGTGAGA-3', 擴增孔鰩cytb部分序列。PCR反應總體積 50 μL, 包括: 2× ES PCR master mix 25 μL(康為世紀生物科技有限公司), 引物(10 μmol/L)各 2 μL, 基因組DNA 50 ng, 補足滅菌雙蒸水至終體積50 μL。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為: 94℃預變性5 min; 94℃變性40 s, 58℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 共35個循環(huán);72℃再延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek)對目的片段回收純化,然后送至上海桑尼生物科技有限公司利用 ABI3730 DNA自動測序儀進行雙向測序。

1.3 DNA序列的數(shù)據(jù)處理

54個樣品的測序結(jié)果用BioEdit軟件進行剪切、拼接和序列核對, 并輔以人工校對。采用MEGA5.05軟件包計算群體相應序列的堿基組成及2009年, 2011年度樣品間的遺傳距離, 構建基于 Kimura-2參數(shù)模型的單倍型鄰接(Neighbor-Joining, NJ)樹, 以Bootstrap 1 000次重復抽樣檢驗分支置信度。用DnaSP5.10軟件計算群體單倍型多樣性指數(shù)(H)、核苷酸多態(tài)性指數(shù)(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)以及群體間遺傳分化系數(shù)(Fst), 繪制單倍型的歧點分布。用Arlequin3.5軟件包計算Tajima’s D和Fu's Fs值, 進行中性檢驗, 以檢驗榮成灣孔鰩cytb這段序列是否符合中性變異, 并根據(jù) pairwise difference模型, 進行分子方差分析(AMOVA)。用Network4.0構建單倍型網(wǎng)絡結(jié)構圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔鰩的cytb部分序列的特征

經(jīng)比對校正后獲得了54尾孔鰩的長度為782bp的cytb基因序列, 未發(fā)現(xiàn)堿基的插入與缺失, 堿基T, C, A, G平均含量分別為0.275±0.105, 0.325±0.098,0.265±0.061, 0.135±0.054, 其中 A+T(54%)平均含量略大于G+C(46%), 與其他硬骨魚類相似[20]。序列中共出現(xiàn)11個單倍型, 檢測到多態(tài)位點15個, 占核苷酸總數(shù)的1.92%, 簡約信息位點6個, 單一變異位點9個。序列中發(fā)生轉(zhuǎn)換14次, 顛換1次, 轉(zhuǎn)換明顯高于顛換, 轉(zhuǎn)換與顛換的比值遠高于 Li[21]所提出的期望值 0.5, 表明此片段沒有飽和, 適合進行遺傳變異分析。其中, 2009年群體序列中共出現(xiàn)3個單倍型,檢測到多態(tài)位點4個, 全部為單一變異位點; 2011年群體序列中出現(xiàn)9個單倍型, 檢測到多態(tài)位點12個,包括簡約信息位點6個, 單一變異位點6個。

在檢測到的11個單倍型中, Hap1在2個年度中均有出現(xiàn), 為共享單倍型, 其頻率也最高, 為70.4%, 其他單倍型則僅在1個年度出現(xiàn), 在獨享單倍型中, 除Hap5、Hap7外, 其余單倍型均只檢出一次(表 1)。

表1 榮成灣2009年和2011年孔鰩群體線粒體cytb基因單倍型分布Tab. 1 The cytb haplotype distribution in 2009 and 2011 Raja porosa groups in the Rongcheng Bay

2.2 榮成灣孔鰩群體的系統(tǒng)發(fā)育與遺傳分化

榮成灣孔鰩群體的單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)見表 2。其單倍型多樣性指數(shù)為0.498, 核苷酸多樣性指數(shù)為0.0018。2009年孔鰩群體單倍型多樣性指數(shù)為0.378, 2011年群體較2009年略高, 為0.532。2個年度核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.0010和0.0020, 也是2011年的略高于2009年的。

表2 榮成灣2009, 2011年孔鰩群體cytb基因部分序列的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 2 Genetic diversity parameters of partial cytb gene sequences of R. porosa groups in the Rongcheng Bay in 2009 and 2011

2009年和 2011年孔鰩群體內(nèi)的 K2p (Kimura 2-parameter)遺傳距離分別為 0.0015和 0.0013, 而 2個年度群體間的遺傳距離則為0.0013,Fst為0.01778,表明 2個年度群體間無顯著遺傳分化。榮成灣孔鰩群體年度間和年度內(nèi)的 AMOVA結(jié)果顯示, 遺傳變異主要集中在相同年度內(nèi)的個體間, 占 98.22%, 年度間變異僅占1.78%, 年度內(nèi)變異大于年度間變異。2009年和 2011年群體并不存在顯著的遺傳結(jié)構差異。

使用K2p模型構建的11種單倍型的鄰接系統(tǒng)樹如圖 1所示, 11種單倍型明顯形成了兩支, 其中Hap4, Hap7, Hap9聚成一支, 其余單倍型聚成一支。2009年和2011年樣品來源的單倍型分布于各支, 沒有表現(xiàn)出明顯的聚群。利用個體序列構建的鄰接系統(tǒng)樹與單倍型所建進化樹結(jié)果一致(圖2)。

圖1 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列單倍型鄰接樹Fig. 1 Haplotype neighbor-joining tree constructed from partial sequences of cytb in Raja porosa stock of the Rongcheng Bay

用Network的Median-joining方法構建的單倍型網(wǎng)絡結(jié)構如圖3, 所有單倍型通過單一突變和多步突變相連接, 單倍型 Hap1是共有的單倍型, 在 2009,2011年群體中所占比例均最高, 據(jù)此推測Hap1是原始單倍型, 其他單倍型是由其演化而來[22]。單倍型網(wǎng)絡圖的結(jié)果也支持不存在與年度相對應的單倍型分支。

2.3 種群歷史動態(tài)

榮成灣孔鰩群體的Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢測都呈顯著性負值(表 2), 此外, 榮成灣群體的歧點分布也呈單峰(圖 4), 表明榮成灣孔鰩群體在過去可能發(fā)生了種群的快速擴張[23-24]。

3 討論

線粒體DNAcytb部分序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量群體遺傳多樣性水平的重要指標。通過與目前已報道的其他 8種軟骨魚類的相關數(shù)據(jù)比較可知(表 3), 榮成灣孔鰩的H與同屬的Raja clavata相近, 略高于西大西洋護士鯊(Ginglymostoma cirratum)和西南大西洋舒氏星鯊(Mustelus schmitti), 而低于其他5種軟骨魚類。但其π值卻明顯低, 除了與西南大西洋舒氏星鯊接近和略低于三種睡鯊Somniosus pacificus,S. antarcticus和S. microcephalus外, 遠遠低于同科的鰩類(Amblyraja radiata)以及鷂鲼科的Aetobatus narinari、甚至同屬的Raja clavata歐洲群體。榮成灣孔鰩具有如此低的H和π值(H＜0.5,P＜0.005), 不僅顯示該群體的遺傳多樣性水平較低, 根據(jù)Grant等[25]的理論推測, 榮成灣孔鰩群體近期也可能發(fā)生了遺傳瓶頸效應或奠基者效應, 其原因是由于孔鰩的遷徙性不強, 少與其他群體發(fā)生基因交流所致, 還是其他原因引起的,尚需進一步予以考證。

圖2 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列個體鄰接樹Fig. 2 Neighbor-joining tree constructed from partial sequences of cytb in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

群體遺傳多樣性是生物適應環(huán)境與進化的基礎,物種遺傳多樣性低, 則更容易受到環(huán)境變化和過度捕撈的影響[26]。從上述分析的多個群體遺傳多樣性參數(shù)來看, 榮成灣孔鰩的遺傳多樣性水平相對較低,僅從遺傳學角度而言, 該物種的種質(zhì)資源現(xiàn)狀不容樂觀。作為一種需求量較大的傳統(tǒng)漁業(yè)資源, 其種質(zhì)資源遺傳多樣性的保護應該得到足夠的重視, 并進一步采用多種分子標記分析對孔鰩種質(zhì)資源進行中長期評估, 從而為其種質(zhì)資源保護政策制定及實施提供基礎, 避免群體遺傳多樣性的急劇下降。

目前關于水生生物群體遺傳多樣性在時間動態(tài)上的研究相對空間水平研究較少, 而且主要集中在分析親代和子代之間, 以及不同歷史時期之間樣本的遺傳差異[27]。本文對榮成灣2009年和2011年的孔鰩群體的cytb部分序列進行分析, 通過對反映群體間遺傳分化程度的重要指標—遺傳分化系數(shù)計算發(fā)現(xiàn), 孔鰩在2個年度群體間的Fst為 0.01778, 表明2個年度群體間沒有明顯的分化[28]。AMOVA結(jié)果也顯示, 全部的變異幾乎都來源于相同年度內(nèi), 年度間變異僅占 2%。采用 Kimura雙參數(shù)模型計算孔鰩群體不同年度間的遺傳距離發(fā)現(xiàn), 其值也很小, 僅為0.0015。綜合分析, 說明該海域孔鰩群體在時間上不存在明顯的群體遺傳結(jié)構差異, 認為這兩個年度的孔鰩屬同一個群體。但是, 由于2009年所采集到的樣品數(shù)較少, 今后還需逐年采取足夠的樣品數(shù)進行研究, 以更準確全面地了解榮成灣孔鰩的群體遺傳結(jié)構及其年度變化。

圖3 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列單倍型的中接網(wǎng)絡圖Fig. 3 Median Joining Haplotype Network Based on partial sequences of cytb in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

圖4 榮成灣孔鰩群體核苷酸不配對分析圖Fig. 4 Mismatch distribution analysis of cytb partial sequences in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

表3 軟骨魚類群體cytb部分序列的H和πTab. 3 The haplotype diverisity (H)and nucleotide diversity (π)parameters of cytb partial sequences in elasmobranches

致謝: 本文所分析的孔鰩底拖網(wǎng)樣品的采集得到中國科學院海洋研究所線薇微老師、李文龍老師的幫助, 謹此一并致謝。

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