周一春, 胡超群, 彭鵬飛, 羅 鵬, 張呂平

(1. 中國科學(xué)院 南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京100049)

海洋底棲硅藻是鮑、海參和海膽等名貴水產(chǎn)動物苗種生產(chǎn)中的重要餌料, 是影響幼苗成活率和質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[1-2]。與鮑的人工育苗相似, 在海參人工育苗中, 底棲硅藻影響海參幼蟲的附著與變態(tài), 并且海參育苗成功與否、產(chǎn)量的高低與底棲硅藻的數(shù)量與質(zhì)量有著直接的關(guān)系。目前, 北方仿刺參(Apostichopusjaponicus)的繁育及養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)成熟,但熱帶海參人工繁殖和養(yǎng)殖才則剛剛起步, 熱帶海參的營養(yǎng)需要及繁育中適合的餌料種類研究均處于空白狀態(tài), 制約了熱帶海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3-4]。

在硅藻的大規(guī)模培養(yǎng)中, 氮、磷、硅營養(yǎng)元素質(zhì)量濃度和配比以及鹽度、光照、溫度等物理因子被認(rèn)為是影響硅藻生長的重要因子, 不同的培養(yǎng)條件對底棲硅藻的種群結(jié)構(gòu)及其生物量影響顯著[5-6]。同時有研究表明營養(yǎng)元素比例的微小變動會導(dǎo)致原環(huán)境代表種類相對豐度的顯著改變[7-8]。此外, 底棲硅藻種類豐富多樣, 分布廣泛, 生存環(huán)境差異甚大, 一種固定的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)液(如傳統(tǒng)的“f/2”培養(yǎng)液)并不能滿足眾多單種底棲硅藻的快速生長的營養(yǎng)需求[9]。因此研究底棲硅藻的最適培養(yǎng)條件對底棲硅藻的規(guī)模培養(yǎng), 獲得優(yōu)質(zhì)餌料具有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。

作者從西沙永興島附近海域分離到一株底棲硅藻—雙眉藻(Amphorasp.), 經(jīng)海參養(yǎng)殖實(shí)踐證實(shí)該種硅藻是糙刺參(Stichopus horrens)喜食的優(yōu)良餌料。本文首先探討溫度、鹽度、光照和不同質(zhì)量濃度的氮、磷、硅鹽對Amphorasp.生長的影響, 并進(jìn)一步研究氮、磷、硅三種營養(yǎng)鹽多因子組合對其生長的影響, 以期確定Amphorasp.最佳培養(yǎng)條件, 為熱帶海參的底棲硅藻餌料的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

實(shí)驗(yàn)所用藻種采自西沙永興島附近海域, 通過富集培養(yǎng), 分離并純化得到。借助光鏡和電鏡技術(shù),研究了該藻的形態(tài)學(xué)特征, 并通過18S rDNA和5.8S rDNA-ITS序列, 對這株藻進(jìn)行了多相分類鑒定, 判定該藻屬于橋彎藻科(Cymbellaceae)、雙眉藻屬(Amphora), 定名為Amphorasp.。

1.2 藻種培養(yǎng)

藻種的初期維持培養(yǎng)采用添加有 Na2SiO3的 f/2培養(yǎng)基, 培養(yǎng)溫度為(30±0.5)℃, 光照強(qiáng)度為 85～93μmol/(m2·s), 光照周期為 12L:12D, 每天定時進(jìn)行搖瓶。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液為天然海水配制, 鹽度為 35, 所用藥品為分析純。實(shí)驗(yàn)器皿為1L玻璃缸、50～1 000mL三角錐瓶和 10 mL離心管, 所有實(shí)驗(yàn)器皿均先經(jīng)過121℃、20 min高壓滅菌, 冷卻后使用。

1.3 藻生長的測定方法

1.3.1 光密度法

在上述培養(yǎng)條件下, 玻璃缸內(nèi)傾斜放置有若干面積相等的附著基, 每天定時隨機(jī)取出3片, 刮取附著基上的藻細(xì)胞, 稀釋到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度, 充分混勻后用于生長的測定。光密度法參照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行測定, 每次測樣前搖勻, 每次取樣測 8～10個值,從中去除最大值和最小值, 然后求平均代表該樣值。

比生長速率計算公式為:K=(lgAt2-lgAt1)/0.301(t2-t1), 其中,K為相對生長常數(shù);t1為指數(shù)生長期開始時的天數(shù);t2為指數(shù)生長期結(jié)束時的天數(shù);At1為指數(shù)生長期開始的藻液光密度值;At2為指數(shù)生長期結(jié)束的藻液光密度值。

1.3.2 細(xì)胞計數(shù)法

細(xì)胞計數(shù)采用血球計數(shù)板, 每次取樣重復(fù)計數(shù)3次。

1.4 單因子試驗(yàn)設(shè)計

1.4.1 營養(yǎng)鹽單因子試驗(yàn)

本組實(shí)驗(yàn)的物理因子為: 鹽度 35, 溫度 30℃,光照強(qiáng)度(85±7)μmol/(m2·s), 光照周期為 12L:12D,培養(yǎng)時間為8 d。

N、P、Si的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置及實(shí)驗(yàn)方案如下:

以添有Na2SiO3的f/2培養(yǎng)液的N、P、Si為基礎(chǔ), 固定 N、Si質(zhì)量濃度, 改變 P質(zhì)量濃度進(jìn)行試驗(yàn); 同理, 固定 P、Si質(zhì)量濃度, 改變 N質(zhì)量濃度和固定N、P質(zhì)量濃度改變Si進(jìn)行試驗(yàn), 分別設(shè)置6 個梯度: 0、1/100、1/10、1、10、100(表 1)。每組設(shè)置 3個平行, 選取指數(shù)期的藻種加入各個質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液中, 并使每種單因子的初始培養(yǎng)液的A680nm值基本相同。

表1 實(shí)驗(yàn)N、P、Si的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置Tab. 1 The gradient concentrations of N, P, Si

1.4.2 環(huán)境因子實(shí)驗(yàn)

本組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液采用添加Na2SiO3的f/2培養(yǎng)液,光照周期為12L:12D, 培養(yǎng)時間為8d。每個物理因子梯度設(shè)置如表2, 每組設(shè)置3個平行, 選取指數(shù)期的藻種加入各個質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)液中, 并使每種單因子的初始培養(yǎng)液的A680nm值基本相同。

表2 物理因子梯度設(shè)置Tab. 2 The gradients of Physical factors

1.5 數(shù)據(jù)的處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,依據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要做相關(guān)性分析、方差分析和LSD多重比較, 顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 光密度法和細(xì)胞計數(shù)法檢測 Amphora sp.生長的相關(guān)性

由圖1可知, 不同的接種密度培養(yǎng)Amphorasp.,光密度法和細(xì)胞計數(shù)法顯示很好的相關(guān)性, 兩種方法反映該藻生長趨勢基本一致, 通過Pearson相關(guān)性檢測, A圖和B圖的相關(guān)系數(shù)為0.997和0.996, 顯著性相關(guān)(P=0.01)。

圖1 Amphora sp.在不同接種密度下的光密度和細(xì)胞計數(shù)法的相關(guān)性Fig. 1 Correlation between the values of OD680 and their cell counts per area of Amphora sp. under different inoculations

2.2 光照強(qiáng)度對Amphora sp.生長的影響

不同光照強(qiáng)度對底棲硅藻Amphorasp.生長的影響如圖2所示。單因素方差分析表明, 該藻的相對生長常數(shù)差異顯著(P=0.000), 說明光照強(qiáng)度對Amphorasp.的生長影響顯著, 多重比較得知,Amphorasp.最適生長光照強(qiáng)度為 56～99 μmol/(m2·s)。

圖2 不同光照強(qiáng)度對Amphora sp.生長的影響Fig. 2 Effect of light intensity on growth of Amphora sp.

2.3 溫度對Amphora sp.生長的影響

不同的溫度對Amphorasp.生長的影響如圖 3所示。單因素方差分析表明, 該藻的相對生長常數(shù)差異顯著(P=0.000), 說明不同溫度對Amphorasp.的生長影響顯著。當(dāng)溫度很低時, 該藻只能極緩慢地生長, 在20～30℃時, 隨著溫度的升高, 比增長速率K增大, 通過LSD多重比較得知, 該藻的最適溫度在25～30℃。

2.4 鹽度對Amphora sp.生長的影響

不同的鹽度對Amphorasp.生長的影響如圖4所示, 單因素方差分析表明, 該藻的相對生長常數(shù)差異顯著(P=0.003), 說明不同鹽度對Amphorasp.的生長影響顯著, LSD多重比較得知, 該藻的最適鹽度30～35, 鹽度過高或過低都會抑制該藻的生長, 且高鹽比低鹽抑制明顯。

圖3 不同溫度對Amphora sp.生長的影響Fig. 3 Effect of temperature on growth of Amphora sp.

圖4 不同鹽度對Amphora sp.生長的影響Fig. 4 Effect of salinity on growth of Amphora sp.

2.5 氮質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響

不同氮的質(zhì)量濃度對Amphorasp.生長的影響如圖5所示, 單因素方差分析表明, 該藻的相對生長常數(shù)差異顯著(P=0.000), 說明不同氮質(zhì)量濃度對Amphorasp.的生長影響顯著, LSD多重比較得知, 在氮質(zhì)量濃度0～750 mg/L范圍內(nèi), 隨著氮質(zhì)量濃度的增加, 該藻的相對生長速率也逐漸增大, 且表明該藻在質(zhì)量濃度為750 mg/L和7 500 mg/L時, 該藻的相對生長速率K沒有差別(P＞0.05)。

圖5 不同氮質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響Fig. 5 Effect of NaNO3-N concentration on growth of Amphora sp.

2.6 磷質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響

不同磷質(zhì)量濃度對Amphorasp.生長的影響如圖6所示, 在一定范圍內(nèi), 隨著磷質(zhì)量濃度的增加, 該藻的生長也加快, 單因素方差分析表明, 該藻的相對生長常數(shù)差異顯著(P=0.000), 說明不同磷質(zhì)量濃度對Amphorasp.的生長影響顯著。多重比較得知, 44 mg/L時相對生長常數(shù)達(dá)到最大。

圖6 不同磷質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響Fig. 6 Effect of NaH2PO4-P concentration on growth of Amphora sp.

2.7 硅質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響

不同硅質(zhì)量濃度對Amphorasp.生長的影響如圖7所示, 該種底棲硅藻的生長速率在硅鹽質(zhì)量濃度為零時非常低, 隨著硅鹽質(zhì)量濃度的升高而迅速增加。單因素方差分析, 表明該藻的比生長速率差異極顯著(P=0.000), 說明不同硅質(zhì)量濃度對Amphorasp.的生長影響顯著, 多重比較得知,該藻的最適硅質(zhì)量濃度為150 mg/L。

圖7 不同硅質(zhì)量濃度對Amphora sp.生長的影響Fig. 7 Effect of Na2SiO3-Si concentration on growth of Amphora sp.

2.8 氮、磷、硅的正交實(shí)驗(yàn)

2.8.1 正交試驗(yàn)設(shè)計

選擇NaNO3-N、Na2SiO3-Si、NaH2PO4-P三因子對Amphorasp.進(jìn)行了生長速率的影響試驗(yàn), 均取三水平(表 3), 各因子水平的確定主要根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中單因子試驗(yàn)結(jié)果。正交試驗(yàn)表4選用L9(34)。

表3 正交試驗(yàn)因素及水平Tab. 3 Factors and levels of orthogonal tests mg/L

表4是Amphorasp.營養(yǎng)鹽L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果,由極差數(shù)值R可見, 三種營養(yǎng)鹽的質(zhì)量濃度對該藻的影響作用由強(qiáng)到弱依次是: NaH2PO4-P＞NaNO3-N＞Na2SiO3-Si。正交實(shí)驗(yàn)方差分析(表 5)表明 3種營養(yǎng)鹽對Amphorasp.的生長都有顯著影響, 其中磷酸二氫鈉、硝酸鈉的作用極其顯著, 綜合分析得出培養(yǎng)Amphorasp.的氮、磷、硅的最適質(zhì)量濃度配比是N:P:Si=2.4:1:3.4, 即本實(shí)驗(yàn)的2號實(shí)驗(yàn)。

3 討論

由圖1可知, 不同的接種密度培養(yǎng)Amphorasp.,兩種方法反映該藻生長趨勢基本一致。Pearson相關(guān)性檢測A圖和B圖的相關(guān)系數(shù)為0.997和0.996, 呈顯著性相關(guān)(P=0.01), 光密度法和細(xì)胞計數(shù)法顯示很好的相關(guān)性。在生長對數(shù)期末期到穩(wěn)定期, 可能由于該藻分泌胞外分泌物, 較之細(xì)胞計數(shù),A680nm值會略高, 但兩種方法在反映藻細(xì)胞生長狀態(tài)上顯示較好的相關(guān)性, 這與之前的研究一致[10], 隨著培養(yǎng)時間的延長, 細(xì)胞生長經(jīng)穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期, 細(xì)胞數(shù)會減少, 但細(xì)胞的胞外分泌物并不會立即停止, 二者數(shù)據(jù)的顯示就會出現(xiàn)很大的差異, 相關(guān)性較低[12]。光密度法檢測該藻生長率選用A680nm, 研究表明在該波長是, 分光光度計的靈敏度最高, 結(jié)果較為可靠。作者認(rèn)為, 在進(jìn)行A值檢測操作時盡量保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性, 進(jìn)行多次測量, 避免數(shù)據(jù)的偶然性會得出準(zhǔn)確的結(jié)果。該方法在檢測各項(xiàng)指標(biāo)的優(yōu)劣性上是可行的, 尤其在檢測的指標(biāo)較多時, 該方法較為便捷,也能在一定程度避免細(xì)胞計數(shù)的主觀誤差。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab. 4 Results of orthogonal test L9(34)design

表5 正交結(jié)果的方差分析Tab. 5 Variance analysis of orthogonal test results

底棲硅藻營自養(yǎng)生活, 必須依靠光合作用來合成有機(jī)物質(zhì)。光強(qiáng)和光質(zhì)都會影響底棲硅藻的光合作用以及藻的群落、種群動態(tài)和適應(yīng)模式[13]。郭峰等報道了底棲硅藻適宜生長的光強(qiáng)一般為21.4～78.6μmol/(m2·s)[14], 最適光強(qiáng)因種類不同而有所區(qū)別, 如亞歷山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)適于光照較強(qiáng)的環(huán)境, 在 78.6 μmol/(m2·s)迅速生長, 而卵形(Cocconeissp.)則在 47.1μmol/(m2·s)生長最好[14]。光過強(qiáng)會發(fā)生光飽和現(xiàn)象, 甚至發(fā)生光氧化。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Amphorasp.適宜生長的光強(qiáng)為 56～99μmol/(m2·s)。與上述藻類最適光照強(qiáng)度不同原因可能是Amphorasp.分離自西沙熱帶海域的潮間帶, 水體的透明度非常高。Amphorasp.適宜生長光照值反映了棲息的環(huán)境特征。

溫度是影響藻類細(xì)胞生理變化的主要因素[15]。對光自養(yǎng)生物, 溫度通過控制酶動力學(xué)來調(diào)節(jié)其生長[16]。硅藻多在溫度較低的冬春季生長繁殖[17], 各種硅藻各有其適溫范圍, 高溫和低溫都會危害底棲硅藻的生長。Amphorasp.適宜溫度為25～30℃, 與丁蕾等[18]報道的擬菱形藻(Pseudo-nitzschiasp.)高密度出現(xiàn)在 25～30℃相似, 但比一般的底棲硅藻的適宜溫度 10～20℃高, 與該藻生長的熱帶西沙海域偏高溫的環(huán)境相一致。

鹽度在不僅影響硅藻的分布, 而且是使某些硅藻形成水華的重要原因。在最適范圍內(nèi)生長、繁殖速度最快。超出適鹽范圍, 過高和過低的鹽度都會傷害藻類細(xì)胞都會產(chǎn)生[15]。馬美榮等[19]培養(yǎng)的咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)在鹽度在8～60時生長速率逐漸減慢, 郭峰等[14]培養(yǎng)的矮小卵形藻(Cocconeis diminuta)和亞歷山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)的最適鹽度分別為30和35,在20～40 鹽度范圍都能良好的生長, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。同時 Clavero等[20]在34株底棲硅藻的鹽度試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 大部分培養(yǎng)的種屬表現(xiàn)出極度的廣鹽性,最適鹽度在30。說明不同藻種最適質(zhì)量濃度不同, 本實(shí)驗(yàn)Amphorasp.采自西沙永興島海域, 最適生長鹽度為30～35, 也是長期適應(yīng)的結(jié)果。

氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的重要元素, 是影響底棲硅藻細(xì)胞生長與分裂的重要元素[18], 是底棲硅藻生長與繁殖的一個限制性因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在 0～750 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 隨著氮質(zhì)量濃度的增加,藻細(xì)胞比生長速率也相應(yīng)增加, LSD多重比較得知,該藻在質(zhì)量濃度為750 mg/L和7500 mg/L時, 該藻的相對生長速率K沒有差別(P＞0.05)。董金利等[21]研究了氮、磷營養(yǎng)鹽對底棲硅藻縊縮菱形藻(Nitzschiaconstricta)的生長及生化組成影響中表明,該藻在最大氮質(zhì)量濃度900 mg/L時, 該藻的比生長速率達(dá)到最大。一般認(rèn)為, 不同的藻種有不同的最適氮質(zhì)量濃度。在藻類的規(guī)模化培養(yǎng)中, 營養(yǎng)鹽的投入多少直接影響成本的高低, 選擇合適的氮質(zhì)量濃度既要保證藻類的較快速生長, 又要講究社會效益。

由于硅藻的硅質(zhì)外殼, 硅是硅藻的必需營養(yǎng)元素.除了作為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分外, 還參與光合色素的合成、蛋白質(zhì)的合成、DNA的合成和細(xì)胞分裂等多種代謝和生長過程[22]。 盡管如此, Shifrin[23]曾報道,一種小環(huán)藻在硅饑餓后大約一代時間內(nèi), 細(xì)胞分裂就完全停止, 但馬志珍[24]在實(shí)驗(yàn)室用自然海水培養(yǎng)單種底棲舟形藻(Neviculasp.)時也發(fā)現(xiàn), 即使不加硅鹽, 硅藻仍能生長良好。大貝政治[25]等采用營養(yǎng)去除法的實(shí)驗(yàn)表明, 用完全不含硅的人工海水培養(yǎng)液培養(yǎng)一種卵形藻Cocconeissp.時, 對其生長的抑制作用很小。由圖6可知, 當(dāng)硅鹽質(zhì)量濃度為零時, 雙眉藻仍能較緩慢生長, 但在0～15 mg/L時, 該藻的相對生長常數(shù)沒有太大變化, 當(dāng)硅的質(zhì)量濃度增加到150 mg/L時,Amphorasp.呈快速增長,進(jìn)一步證明傳統(tǒng)的 f/2海水培養(yǎng)基不能滿足該藻快速生長的營養(yǎng)需要。

磷是細(xì)胞膜的重要成分, 在細(xì)胞的能量傳遞中起著重要的作用, 而培養(yǎng)液中的磷對培養(yǎng)液的酸堿度起緩沖作用[18]。在藻類培養(yǎng)中, 磷的用量一般都比氮小, 但由于磷的化合物的溶解性和移動性較差,磷對水體初級生產(chǎn)力的限制作用更顯著[26], 本文的單因子試驗(yàn)中這一結(jié)論同樣得到證實(shí)。有研究表明,微藻對營養(yǎng)鹽的攝取不是單獨(dú)進(jìn)行的, 而是按一定比例吸收, 營養(yǎng)鹽之間的比例, 尤其是氮磷的質(zhì)量濃度配比對細(xì)胞的生長發(fā)育有重要作用[27-28]。各種單細(xì)胞藻所要求的N、P比例不同。王淵源等[29]實(shí)驗(yàn)表明, 小型舟形藻(Navicula parva)最佳 N: P=65:1,在此條件下細(xì)胞數(shù)量增加最為明顯。單因子試驗(yàn)沒有考慮營養(yǎng)鹽之間的配比, 存在一定的缺陷。藻類生長狀態(tài)是多因子同時作用的結(jié)果, 所以多因子組合實(shí)驗(yàn)更能真實(shí)反映它們的營養(yǎng)需求, 更接近藻類培養(yǎng)的最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)在N:P:Si=2.4:1:3.4時該雙眉藻的生長最好, 而與李雅娟等[9]培養(yǎng)的咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)的最佳配比為 2.5:1:2接近,兩者都與馬志珍[24]報道的舟形藻(Naviculasp.)最適質(zhì)量濃度都不同, 說明不一樣的藻類適宜的營養(yǎng)鹽比例有異。同是雙眉藻, 分布在不同的海域, 環(huán)境條件不同, 也會表現(xiàn)出不同的營養(yǎng)需求。

[1]陳明耀. 生物餌料培養(yǎng) [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[2]陳世杰, 陳木, 盧豪魁, 等. 鮑苗的餌料-底棲硅藻培養(yǎng)試驗(yàn)初報 [J]. 動物學(xué)報, 1977, 23(1): 47-52.

[3]袁成玉. 海參飼料研究的現(xiàn)狀與發(fā)展方向 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2005, 24(012): 54-56.

[4]張春云, 王印庚, 榮小軍, 等. 國內(nèi)外海參自然資源、養(yǎng)殖狀況及存在問題[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2004,25(3): 89-97.

[5]Rivkin R B, Putt M. Photosynthesis and cell division by antarctic microalgae:comparion of benthic, planktonic and ice algae [J]. Journal of phycology, 1987, 23: 223-229.

[6]Snyder E B, Robinson C T, Minshall G W. et al. Regional patterns in periphyton accrual and diatom assemblage structure in a heterogeneous nutrient landscape [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2002, 59(3): 564-577.

[7]Agatz M, Asmus R, Deventer B. Structural changes in the benthic diatom community along a eutrophication gradient on a tidal flat [J]. Helgoland Marine Research,1999, 53(2): 92-101.

[8]Armitage A R, Frankovich T A, Fourqurean J W. Variable responses within epiphytic and benthic microalgal communities to nutrient enrichment [J]. Hydrobiologia,2006, 569(1): 423-435.

[9]李雅娟, 王起華. 氮, 磷, 鐵, 硅營養(yǎng)鹽對底棲硅藻生長速率的影響 [J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 1998,13(4): 7-14.

[10]Wang Q H, Wang S H, Ding M J, et al. Studies on culture conditions of benthic diatoms for feeding abalone[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology,1998, 16(1): 78-83.

[11]周銀環(huán). 氮, 磷, 鐵, 硅對簡單雙眉藻生長的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 2008, 28(1): 35-39.

[12]Hoagland K D, Rosowski J R, Gretz M R, et al. Diatom extracellular polymeric substances: function, fine structure, chemistry and physiology[J]. Journal of phycology, 1993, 29:537-566.

[13]莊樹宏. 光強(qiáng)和光質(zhì)對底棲藻類群落影響Ⅱ. 群落和種群的動態(tài)和適應(yīng)模式 [J]. 生態(tài)學(xué)報, 2001, 21(12):2057-2066.

[14]郭峰, 朱凌俊, 柯才煥, 等. 兩種海洋底棲硅藻的培養(yǎng)條件研究 [J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005,44(6):831-835.

[15]華汝成. 單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與利用 [M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986.

[16]Davison I R. Environmental effects on algal photosynthesis: temperature [J]. Journal of phycology, 1991,27(1): 2-8.

[17]陳峰, 姜悅. 微藻生物技術(shù) [M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999.

[18]丁蕾, 支崇遠(yuǎn). 環(huán)境對硅藻的影響及硅藻對環(huán)境的監(jiān)測 [J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版 2006, 24(3):13-16.

[19]馬美榮, 李朋富, 陳麗, 等. 鹽度和營養(yǎng)限制對鹽田底棲硅藻咖啡雙眉藻生長及胞外多糖產(chǎn)率的影響[J]. 鹽業(yè)與化工, 2008, (5): 30-34.

[20]Clavero E, Hernández-Mariné M, Grimalt J O, et al.. Salinity tolerance of diatoms from thalassic hypersaline environments [J]. Journal of Phycology, 2000, 36(6):1021-1034.

[21]董金利, 莊惠如, 占美憐,等. 氮, 磷營養(yǎng)鹽對底棲硅藻的生長及生化組成影響[J]. 生物技術(shù),2010,20:64-67.

[22]Werner D. The biology of diatoms [M]. California:Univ of California Press, 1977.

[23]Shifrin N S, Chisholm S W. Phytoplankton lipids:interspecific differences and light-dark cycles[J].Journal of phycology, 1981, 17(4): 374-384.

[24]馬志珍, 季梅芳, 陳匯遠(yuǎn). 一種可做鮑和海參餌料的底棲舟形藻的培養(yǎng)條件的研究[J]. 海洋通報, 1985,4(4): 36-39.

[25]大貝政治, 松井敏夫, 高木博之. 附著硅藻Cocconeis sp.の增殖に及 ぽ環(huán)境諸要因の影響[J].水產(chǎn)增殖, 1992, 40(2): 240-246.

[26]吳春雪. 兩種海洋底棲硅藻生長條件及生化成分的研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2008.

[27]Smith R E H, Geider R J. Kinetics of intracellular carbon allocation in a marine diatom[J]. Journal of Experimental Marine Biology And Ecology, 1985, 93(3):191-210.

[28]Thomas W H, Dodson A N. Effects of phosphate concentration on cell division rates and yield of a tropical oceanic diatom [J]. The Biological Bulletin, 1968,134(1): 199-208.

[29]王淵源, 姜慶國, 江航宇. 培養(yǎng)小型舟形藻的氮、磷肥料量 [J]. 海洋科學(xué), 1986, 10(5): 35-37.