陳玉斌，劉孝菊，姚 娜，孫常文，田海山,4，張 鍵，劉 敏，李校堃,3,4

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心,吉林 長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118;3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點實驗室,吉林 長春 130021;4.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 生物技術(shù)制藥工程重點實驗室，浙江 溫州 325035)

成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)于2000年被成功鑒定[1]，作為一種調(diào)磷因子，其通過抑制磷的重吸收及增加磷的外分泌在腎臟中發(fā)揮重要的作用[2]。許多研究[2-4]證實：人類FGF23基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性低磷血癥(autosomai dominant hypophosphatemic rickets，ADHR)、X-連鎖低磷血癥性佝僂病(X-linked hypophosphatemia，XLH)以及腫瘤誘發(fā)性骨軟化癥(tumor-induced osteomalacia，TIO)等疾病，而且FGF23在慢性腎病伴發(fā)的繼發(fā)性甲狀旁腺亢進(jìn)的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[5-6]，尤其是在慢性腎病患者(chronic kidney disease，CKD)早期磷穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用[7]。研究[8]證實：多數(shù)血液透析患者血清FGF23濃度超過正常人的 100～1 000倍[8]。腎功能下降后血清FGF23水平緩慢升高，CKD和終末期腎病患者血清FGF23的水平增高，而腎移植后可下降到正常水平[9]。Ferrari等[10]通過改變健康人飲食中磷的含量，觀察到血清FGF23的改變與24 h尿磷的清除成正相關(guān)，表明FGF23的代謝水平與CKD患者的患病程度相關(guān)。本研究利用原核表達(dá)載體表達(dá)了FGF23的活性片段(FGF23CTR)與GST的融合蛋白，并做了純化和初步的免疫原性分析，顯示融合蛋白中的FGF23CTR片段能夠在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高活性的抗體，為進(jìn)一步制備特異性針對FGF23的單克隆抗體提供了條件，也為CKD診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株﹑質(zhì)粒及主要試劑大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)菌種及pGEX-4T-1質(zhì)粒為生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心保存，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Xhol Ⅰ PCR反應(yīng)的相關(guān)酶類及T4DNA連接酶均為TakaRa公司產(chǎn)品，DNA Marker DL2 000和低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購于寶生物工程(大連)公司，IPTG 購自鼎國生物工程公司，PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒購自長春百金生物試劑經(jīng)銷有限公司，Glutathione Sepharose 4B購自Pharmacia公司，弗氏佐劑購自Sigma公司，F(xiàn)GF23多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，帶有辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京博奧森生物公司，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。6～ 8周齡雌性 Balb/C小鼠，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。

1.2 目的基因擴(kuò)增以人源FGF23基因為模板用特異性引物擴(kuò)增FGF23CTR基因。首先，依據(jù)GenBank中人類FGF23的基因序列設(shè)計合成一對引物，上游引物F：5′-CGTGGATCCCGGAGCG-CCGAGGACGACTCG-3′含有BamH Ⅰ酶切位點；下游引物R：5′-CACGCTCGAGTTACTAGATGAACTTGGCG-3′含有XhoⅠ酶切位點。PCR擴(kuò)增條件：94℃、5 min；94℃、30 s，59.4℃、30 s，72 ℃、40 s，30個循環(huán)；72℃、7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓100 V，35 min，EB染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切消化，切膠回收酶切片段，并與用同樣的酶進(jìn)行處理的pGEX-4T-1質(zhì)粒進(jìn)行連接，熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布平板法篩選陽性菌株，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定。

1.3 GST-FGF23CTR表達(dá)菌的篩選將測序正確的重組質(zhì)粒保種菌按1%的接種量轉(zhuǎn)接于小試管中，37℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中，氨芐抗性平板篩選出陽性菌株。將陽性菌落過夜培養(yǎng)物按2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中(Amp+)，振蕩培養(yǎng)至A600值在0.4～ 0.6，加IPTG 至終濃度1 mmol·L-1繼續(xù)震蕩培養(yǎng)1 h，離心收集菌體，進(jìn)行 12%SDS-PAGE電泳分析。

1.4 表達(dá)條件的優(yōu)化及可溶性分析表達(dá)菌分別用0.4、0.8和1.0 mmol·L-1的IPTG，在25℃和37℃條件下，分別誘導(dǎo)表達(dá)4、8和12 h取樣，離心回收菌體，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析，選取最優(yōu)的表達(dá)條件，并且超聲破碎菌體，分別將上清和沉淀取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.5 融合蛋白的純化將大量擴(kuò)增誘導(dǎo)表達(dá)后的表達(dá)菌以8 000 r·min-1離心10 min收菌，菌體用預(yù)冷的裂解緩沖液(PBS，140 mol·L-1NaCl，2.7 mol·L-1KCl，10 mol·L-1Na2HPO4，1.8 mol·L-1KH2PO4，pH 7.3)重懸，超聲破碎，4℃、12 000 r·min-1離心15 min，棄沉淀。將上清過Glutathione Sepharose 4B柱，先以5倍體積的PBS洗柱，再以適量的洗脫緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1還原性的谷胱甘肽，pH 8.0)洗脫蛋白，純化的蛋白用微量紫外分光光度計測量濃度后，于-20°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 純化后融合蛋白的Western blotting鑒定按照參文[11]的方法將純化后的GST-FGF23CTR融合蛋白及表達(dá)菌誘導(dǎo)前對照以BIO-RAD系統(tǒng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)牛血清白蛋白封閉后，依次加入兔抗人FGF23多抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.7 小鼠免疫首次免疫取含有400 μg GST-FGF23CTR融合蛋白的純化液并添加注射用水至總體積為1.5 mL，用1.5 mL弗氏完全佐劑充分乳化、混勻。取4只小鼠,在小鼠腹部皮下進(jìn)行多點注射,每只注射0.75 mL;之后每隔2周用同樣方法注射弗氏不完全佐劑乳化混勻的GST-FGF23CTR融合蛋白抗原;免疫4次后,通過尾部采血來制備抗血清。

1.8 ELISA法檢測抗血清效價按照參文[12]的方法檢測抗血清的效價，首先建立ELISA反應(yīng)體系，通過棋盤方陣滴定法確定抗原包被濃度。然后將GST-FGF23CTR融合蛋白和GST蛋白分別用抗原稀釋液稀釋至合適的包被濃度，加入100 μL/孔，4℃包被過夜。將待測血清分別按至1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000的倍數(shù)稀釋，也是100 μL/孔，在37℃孵育1 h。再加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(效價1∶3 000)稀釋液，37℃反應(yīng)1 h，洗滌后加入底物顯色，10 min，終止反應(yīng)后測定490 nm 處的A值。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條長度約為250 bp的明亮條帶，與理論值相符。見圖1。

圖1 FGF23CTR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)化子的陽性鑒定用高保真酶做PCR，用膠回收試劑盒回收目的片段，同時用質(zhì)粒提取試劑盒提取出pGEX-4T-1質(zhì)粒，兩者分別進(jìn)行雙酶切(BamHⅠ/XholⅠ)，T4連接酶16℃過夜連接，次日將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到DH5α中，涂布到Amp抗性平板上。從抗性篩選出的菌落中隨機(jī)挑取19個菌落做PCR鑒定，結(jié)果顯示有3個陽性菌落(圖2)。將3個菌種送北京華大基因測序公司測序，結(jié)果顯示序列均與理論序列一致。

圖2 FGF23CTR轉(zhuǎn)化子的菌落PCR陽性鑒定

2.3 表達(dá)菌的篩選將重組質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中，利用IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE分析，篩選出表達(dá)菌。結(jié)果顯示:在34 000處有目的條帶的表達(dá)，與理論值相符。同時在約26 000處也出現(xiàn)1個表達(dá)條帶。見圖3。其原因是pGEX-4T-1質(zhì)粒本身攜帶有GST基因的起始密碼子，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后可以表達(dá)出GST蛋白。因此，將野生型的pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21中，并篩選表達(dá)菌(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖3 融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)，在25℃和37℃、于不同的誘導(dǎo)時間取樣，行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示：菌體在不同IPTG濃度下都有高量的表達(dá)，0.4 mmol·L-1IPTG、25℃、誘導(dǎo)8 h菌體表達(dá)量達(dá)到最高，實驗選擇誘導(dǎo)條件為表達(dá)的最優(yōu)條件。在各濃度IPTG誘導(dǎo)下，25℃時均比37℃時的表達(dá)量高，說明低溫有利于蛋白的表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)：隨著時間的延長，到12 h時誘導(dǎo)量又有所下降。見圖4。

圖4 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.5 融合蛋白的表達(dá)位置分析和純化蛋白在上清表達(dá)，經(jīng)過Glutathione Sepharose 4B親和層析純化得到了純度大于90%的融合蛋白，由于質(zhì)粒本身可以表達(dá)出GST蛋白，因此純化的蛋白中還有少許GST蛋白殘余。隨著洗脫時間的延續(xù)，在洗脫的最后出現(xiàn)了僅有少許雜帶的蛋白，可以作為抗原免疫小鼠。見圖5。

圖5 目的蛋白的表達(dá)和純化

2.6 Western blotting 鑒定結(jié)果表達(dá)的融合蛋白能夠與FGF23多克隆抗體特異性結(jié)合,如圖6所示,說明純化出來的蛋白是GST-FGF23CTR融合蛋白，可以作為抗原免疫動物，用于FGF23CTR單克隆抗體的制備。

圖6 純化的GST-FGF23CTR的Western blotting分析結(jié)果

2.7 ELISA檢測結(jié)果與免疫前血清(隱性對照)和水(空白對照)比較，4只免疫小鼠體內(nèi)均獲得較高效價的抗體，平均效價為1∶16 000。

為了驗證所產(chǎn)生的抗體是針對于FGF23CTR的片段而并非全部是GST決定簇的抗體，又純化出了GST蛋白(純化的蛋白圖片未顯示)，與融合蛋白分別包被，并隨機(jī)抽取2只小鼠的抗血清，行ELISA檢測，結(jié)果顯示：融合蛋白的A490值幾乎是GST蛋白所測值的2～3倍，說明免疫所產(chǎn)生的抗體有一部分是針對FGF23CTR片段的抗體，而且從FGF23CTR片段和GST蛋白的相對分子質(zhì)量大小對比來看，F(xiàn)GF23CTR片段的免疫原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于GST蛋白。

3 討 論

FGF23是多肽激素成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)家族的成員，F(xiàn)GFs家族包括22個功能各異的成員。FGF23基因位于染色體12p13區(qū)，與FGF19 及FGF21 基因產(chǎn)物有著24%和22% 的氨基酸相似性。FGF23 蛋白含有251 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為32 000，除含有FGF 家族同源性結(jié)構(gòu)域N 端外，還包含一個由71個氨基酸組成的特異性C端。FGF23的功能不同于家族其他成員，在腎臟中其主要作用是通過近曲小管上皮細(xì)胞刷狀緣膜上的鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白Ⅱa(NPT2a)內(nèi)移和降解，促進(jìn)磷排泄和抑制1-羥化酶的活性，增加尿磷的排泄，減少腎臟無機(jī)磷重吸收從而調(diào)節(jié)磷的排泄[7]。血清中FGF23主要由成骨細(xì)胞分泌，腎臟是FGF23主要的靶器官，健康人尿中可以檢測到FGF23，提示腎臟可能是FGF23清除的主要器官。因此，純化出FGF23 C端的特異性片段(FGF23CTR)，對于FGF23的研究尤為重要。

鈣磷代謝紊亂是CKD 特別是終末期腎病患者重要的并發(fā)癥之一。研究[14]表明：CKD 時長期的鈣磷代謝紊亂可引發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)、礦物質(zhì)和骨代謝異常,還可引起肺、心肌、心臟瓣膜、血管等轉(zhuǎn)移性鈣化,使患者的生存質(zhì)量下降,而且與慢性腎功能衰竭的死亡率增加相關(guān)聯(lián)。維持合適的鈣磷代謝平衡及甲狀腺激素水平已經(jīng)成為改善CKD患者的生存質(zhì)量和延長壽命極其重要的方法，作為調(diào)磷因子作用的FGF23為CKD患者的治療帶來了希望，并且由于FGF23的代謝水平與CKD不同時期的患病程度相關(guān)[13]，F(xiàn)GF23水平檢測可能起到診斷CKD的作用，用于特異性檢測FGF23的單克隆抗體制備還未見報道。

本研究利用GST表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了GST-FGF23CTR融合蛋白的表達(dá)載體，并且純化得到純度大于90%以上的融合蛋白，經(jīng)ELISA法檢測蛋白具有良好免疫原性。有關(guān)FGF23純化表達(dá)方面的研究少有報道，尤其是FGF23 C末端的71個氨基酸方面的研究亦很少。

本研究對FGF23末端的71個氨基酸的表達(dá)方法做了詳細(xì)研究，為FGF23生理功能的進(jìn)一步研究提供了條件，特別是為制備特異性針對FGF23單克隆抗體及為將來研發(fā)CKD診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。鑒于本研究中表達(dá)的是帶GST標(biāo)簽的融合蛋白，將來做FGF23單克隆抗體時是否把GST標(biāo)簽切掉會更好，尚需進(jìn)一步研究證實。

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