劉飛飛 馬江紅 王秀麗

糖尿病神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年增高，約占30%，其發(fā)病機(jī)制及病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，臨床上缺乏有效的治療藥物和手段。NMDA受體是一種配體門控離子型谷氨酸受體，是興奮性氨基酸受體系統(tǒng)的重要組成部分。NMDA受體是由NR1和NR2亞單位組成的異五聚體，NR1是NMDA受體復(fù)合物的功能單位，NR2是調(diào)節(jié)單位。NMDA受體不僅參與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)育等生理功能的調(diào)節(jié)，而且，在疼痛、神經(jīng)退行性變、癲癇等病理過程中發(fā)揮重要作用。目前研究表明:外周神經(jīng)損傷大鼠脊髓背角神經(jīng)元上NMDA受體表達(dá)上調(diào)［1，2］，而DNP大鼠脊髓背角NMDA受體各亞基的表達(dá)變化目前還不清楚。本研究通過制備DNP大鼠模型，探討其脊髓背角NMDA受體各亞基的表達(dá)變化，為臨床治療DNP提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 清潔級雄性SD大鼠24只，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，4周齡，體重130～150 g，室溫20～25℃，晝夜交替，自由進(jìn)食水，適應(yīng)環(huán)境5 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為2組:正常對照組(C組，n=9)和DNP組(D組，n=15)。

1.2 DNP模型的制備 參考文獻(xiàn)［3］介紹的方法，禁食12 h后腹腔注射鏈脲霉素(STZ，Sigma公司，美國)50 mg/kg，C組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。

分別于注射STZ或0.9%氯化鈉溶液后1、2、3周采集尾靜脈血樣0.5 ml，采用酶學(xué)方法測定空腹血糖濃度，ACCU-CHEK血糖分析儀由德國Roche公司提供，D組空腹血糖濃度 ＞16.7 mol/L為糖尿病模型制備成功;采集血樣后，待大鼠安靜測定機(jī)械縮足閾值(PWT)＜4 g時，為糖尿病神經(jīng)痛模型成功，否則剔除，予以補(bǔ)充。然后取L1～5節(jié)段脊髓組織，采用免疫組織化學(xué)法法測定脊髓背角NMDA受體表達(dá)水平。

1.3 PWT的測定 參照文獻(xiàn)［3］介紹的方法，采用“up-anddown”方法，將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩。使大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的Von Frey針垂直刺激大鼠后足底，使其彎曲成S形，持續(xù)6～8 s，在刺激時間內(nèi)或在移開Von Frey絲時發(fā)生縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，直至出現(xiàn)第1次陽性陰性(或陰性陽性)反應(yīng)的騎跨，連續(xù)測4次。應(yīng)用Dixon［4］報道的方法推算出50%縮足反應(yīng)閾值。

1.4 免疫組織化學(xué)測定脊髓背角NR1和NR2B亞單位的表達(dá)腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉下，迅速開胸，經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以100ml0.9%氯化鈉溶液洗去血液，隨后用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH值7.4)灌注1 h，取L1～5節(jié)段脊髓組織。常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，切片(片厚5μm)。滴加3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加NR1亞單位一抗 (博奧森公司，北京，1∶200稀釋)37℃孵育過夜。次日滴加生物素化的兔抗鼠抗體(北京博奧森公司)，37℃40 min。DAB(北京博奧森公司)顯色。NR2B亞單位一抗、二抗(中杉金橋公司，北京，1∶200稀釋)代替NR1亞單位一抗、二抗，實(shí)驗(yàn)步驟相同。用PBS替代一抗作為陰性對照。采用Motic Digital Image病理圖像采集軟件(Olympus公司，日本)與Quantity One軟件(Bid-Rad公司，美國)進(jìn)行分析，每個標(biāo)本取4張切片，每張切片在脊髓背角選取大致相同部位的視野，光鏡(200倍)計(jì)數(shù)NR1和NR2B陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，取4張切片的平均值反映陽性細(xì)胞的表達(dá)水平。細(xì)胞膜及細(xì)胞漿均呈深棕色為表達(dá)陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行隨機(jī)趨組資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組不同時點(diǎn)血糖與PWT比較 給予STZ后不同時點(diǎn)PWT＜4 g;與C組比較，D組空腹血糖升高，PWT降低 (P＜0.05)。見表1。

表1 2組大鼠給予STZ后不同時點(diǎn)空腹血糖及機(jī)械縮足閾值的比較±s

表1 2組大鼠給予STZ后不同時點(diǎn)空腹血糖及機(jī)械縮足閾值的比較±s

注:與 C 組比較，*P ＜0.05

組別 血糖(mmol/L)PWT(g)3周 5周 7周3周 5周 7周C 組(n=3) 5.7 ±0.9 5.8 ±0.8 5.9 ±0.9 11.0 ±3.1 10.4 ±2.7 10.7 ±2.6 D 組(n=5) 22.8 ±3.2* 22.7 ±2.8* 22.8 ±2.8* 3.3 ±1.0* 2.9 ±1.1* 2.8 ±1.8*

2.2 2組不同時點(diǎn)NR1與NR2B比較 與正常C組各時點(diǎn)比較，D組注射STZ后3周、5周、7周的糖尿病神經(jīng)痛大鼠脊髓背角NR1和NR2B亞單位免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.05)。見表 2。

表2 2組大鼠給予STZ后不同時點(diǎn)脊髓背角NR1和NR2B亞單位表達(dá)的比較±s

表2 2組大鼠給予STZ后不同時點(diǎn)脊髓背角NR1和NR2B亞單位表達(dá)的比較±s

注:與 C 組比較，*P ＜0.05

組別NR1 3周 5周 7周NR2B 3周 5周 7周C組(n=3)31±13 32±12 31±12 40±4 43±4 42±6 D組(n=5) 81±13* 82±12* 72±12* 132±10* 109±17* 68±6*

2.3 細(xì)胞學(xué)檢查 顯微鏡下觀察，NR1和NR2B亞單位主要分布于細(xì)胞膜及胞漿。經(jīng)DAB顯色，使細(xì)胞膜及胞漿呈棕黃色，陽性細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞膜及細(xì)胞漿均著色。見圖1、2。

圖1 2組大鼠脊髓背角NR1亞單位表達(dá)的免疫組化圖

圖2 2組大鼠脊髓背角NR2B亞單位表達(dá)的免疫組化圖

3 討論

本研究結(jié)果表明，D組給予STZ后不同時點(diǎn)機(jī)械縮足閾值＜4 g，且明顯低于C組，提示DNP模型制備成功，DNP大鼠脊髓背角NMDA陽性細(xì)胞明顯增加。

糖尿病作為一種代謝性疾病，可特異性地影響脊髓背根神經(jīng)節(jié)、谷氨酸能神經(jīng)元及其突觸前膜(初級傳入神經(jīng)末梢)的GABAB(1A)亞基的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。在DNP形成過程中，除了初級傳入神經(jīng)對DNP產(chǎn)生作用外，脊髓背角神經(jīng)元過度興奮(中樞敏化)也被認(rèn)為是DNP的一種潛在機(jī)制［6，7］。谷氨酸是初級傳入神經(jīng)末梢釋放的一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在疼痛的形成過程中發(fā)揮重要作用。

本研究免疫組化結(jié)果顯示:DNP組大鼠在STZ注射后5～7周脊髓背角NR1和NR2B亞基免疫陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與Edwards［8］等報道結(jié)果一致，原因?yàn)?蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)是疼痛信號傳遞過程中重要的鈣依賴性第二信使［8］，長期慢性高血糖狀態(tài)可激活PKC，PKC活化后會激活撕裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而引起轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，繼而改變基因表達(dá)，導(dǎo)致大鼠脊髓背角神經(jīng)元NR1和NR2B亞基表達(dá)增多。DNP大鼠脊髓背角神經(jīng)元釋放興奮性谷氨酸遞質(zhì)顯著增加［9，10］，過度激活 NMDA 受體后，相偶聯(lián)的 Ca2+，Na+，K+的通透性也隨之增加，Ca2+內(nèi)流增加，又加速了鈣依賴性興奮性氨基酸釋放，從而引起脊髓的可塑性變化，使信號得以長時間維持，導(dǎo)致中樞敏感化。這種正反饋途徑在持續(xù)性疼痛中的中樞敏化和神經(jīng)元可塑性兩方面具有重要的作用。GABAB受體也可通過磷酸化GABAB1受體亞型C末端867位點(diǎn)上的絲氨酸(S867)，活化興奮性谷氨酸NMDA受體，該位點(diǎn)正是蛋白激酶C(PKC)作用的主要部位［11］。而本實(shí)驗(yàn)中DNP組大鼠自STZ注射后第3周，脊髓背角神經(jīng)元NR1和NR2B陽性細(xì)胞顯著增多，這種增多一直持續(xù)至第5周;而在STZ注射后低七周，DNP組大鼠脊髓背角NR1和NR2B陽性細(xì)胞有減少的趨勢，這可能是:隨著DNP的形成，谷氨酸持續(xù)釋放和NMDA受體誘導(dǎo)的長時間的興奮毒性導(dǎo)致細(xì)胞代謝功能障礙，誘發(fā)脊髓背角細(xì)胞凋亡［12，13］，可能使NMDA受體蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄明顯降低，出現(xiàn)表達(dá)減少，這需要在以后的實(shí)驗(yàn)中延長觀察時間。

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型，采用免疫組織化學(xué)染色觀察正常對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓背角NMDA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠組脊髓背角NMDA受體的免疫陽性神經(jīng)元量明顯增多，這表明，NMDA受體在脊髓水平參與了糖尿病神經(jīng)病理性痛的調(diào)節(jié)。

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