李湘洲，張 勝，李文生，2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

糖尿病的發(fā)生主要是因?yàn)檠堑膩?lái)源與利用之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞.多糖通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)糖代謝酶來(lái)調(diào)節(jié)血糖水平，并通過抗氧化作用對(duì)血糖進(jìn)行調(diào)節(jié)［1－2］.糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種綜合病癥.主要是由于體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足所引起的糖代謝紊亂所致.糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)會(huì)引起失明、肢體壞死等并發(fā)癥［3］.有研究表明茶多糖有較強(qiáng)的降血糖功能［4－5］.而對(duì)油茶餅粕多糖在此方面的研究少有報(bào)道.

油茶餅粕多糖，是指山茶科山茶屬油茶（Camellia oleifera Abel.）經(jīng)過壓榨制油后的種籽中所含的雜多糖類成分.油茶是我國(guó)特有的木本油料，據(jù)《全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009－2020）》統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有油茶林面積302×104hm2，年產(chǎn)油茶餅粕68.39萬(wàn)噸.油茶籽在榨油后形成的餅粕，通常用于提取茶皂素.而據(jù)報(bào)道，榨油后的油茶籽餅粕中化學(xué)成分組成是：脂肪8.73%，水分1.52%，粗蛋白5.85%，皂 素 30.34%，總 糖 50.52%，灰 分2.95%［6］.因此對(duì)糖類化學(xué)成分的研發(fā)對(duì)于延長(zhǎng)油茶產(chǎn)業(yè)鏈、增加副產(chǎn)物的附加值具有重要意義.

由于天然α－葡萄糖苷酶抑制劑在糖尿病飲食療法中具有重要作用，因此研究天然α－葡萄糖苷酶抑制劑的來(lái)源及應(yīng)用十分必要［7］.α－葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型常用于降血糖藥物的體外篩選［8］.α－葡萄糖苷酶是一種存在于小腸黏膜細(xì)胞刷狀緣的糖苷代謝酶，該酶針對(duì)雙糖發(fā)揮水解作用，使進(jìn)入小腸的碳水化合物最終形成單糖，被機(jī)體吸收.因此，通過觀測(cè)α－葡萄糖苷酶活性的變化情況，可獲得藥物抑制血糖的效果.與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)比較，這是一種操作性強(qiáng)且高效的實(shí)驗(yàn)方法.

本文研究油茶餅粕多糖對(duì)體外α－葡萄糖苷酶抑制作用.首先測(cè)定了各分級(jí)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量.采取PMP柱前衍生高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成.然后通過測(cè)定底物（蔗糖）在α－葡萄糖苷酶作用下生成葡萄糖量，計(jì)算樣品對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制率.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

油茶餅粕：品種為普通油茶（Camellia oleifera），采集于湖南省株洲縣，采集時(shí)間為2009年10月.經(jīng)機(jī)械壓榨后的干燥餅狀物即為油茶餅粕.

1.2 試劑與儀器

葡萄糖試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)為112571；蔗糖：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為1003042，用去離子水配制成30 mmol／mL作為底物溶液；阿卡波糖（Acarbose）：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100808－2009202；PBS緩沖鹽：天津津脈公司生產(chǎn)，出廠代碼為JMF－0006；生理鹽水：湖南科倫制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為091103503；DEAE－52纖維素：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；其他試劑為分析純.

酶標(biāo)儀：Thermo公司，型號(hào)Multiskan Ascent，96孔板；大鼠，SD雄性，體重230～270g.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油茶餅粕多糖的制備及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

油茶餅粕多糖：油茶餅粕經(jīng)脫脂、水提取、脫蛋白、乙醇沉淀后凍干獲得油茶餅粕粗多糖（CCP）.粗多糖上DEAE－52纖維素層析柱，先后采用去離子水，0.1mol／mL，0.2mol／mL，0.5mol／mL氯化鈉溶液及0.5mol／mL氫氧化鈉溶液洗脫，分別收集洗脫液后減壓濃縮，透析后冷凍干燥，獲得分級(jí)多糖.以已知系列相對(duì)分子質(zhì)量葡聚糖為對(duì)照品，采用高效凝膠色譜法（HPGPC）測(cè)定各分級(jí)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量.采取PMP柱前衍生高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成［9］.

1.3.2 α－葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

α－葡萄糖苷酶從大鼠腸黏膜內(nèi)提取，于－20℃保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)分為空白組、不加抑制劑的陰性組、阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照組和待測(cè)樣品組.酶液、阿卡波糖、油茶餅粕多糖樣品分別用PBS緩沖液溶解稀釋.在酶標(biāo)儀96孔板中，依次加入如表1所示的各種試劑，經(jīng)過酶液與反應(yīng)底物劑量預(yù)試后，最終反應(yīng)體積50μL，置于37℃恒溫箱保溫20min.

按葡萄糖試劑盒使用的要求，在50μL測(cè)量液中再加入1 500μL酚試劑（試劑盒自帶），混合均勻，于37℃保溫20min，以空白管調(diào)零，在492nm處測(cè)吸光值，吸光值與葡萄糖生成量呈線性相關(guān).根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算IC50（即抑制酶活性達(dá)到50%時(shí)所需要抑制劑的濃度）.

抑制百分率IR＝（A測(cè)試－A樣品－A空白）／（A測(cè)試－A空白）×100%.

表1 各實(shí)驗(yàn)組的溶液配制Tab.1 Reagents in each experimental groupμL

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖純化與相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試的結(jié)果

經(jīng)過DEAE－52纖維素柱層析對(duì)粗多糖樣品的分離，不同溶劑洗脫后獲得的5個(gè)分級(jí)多糖.分別命名為CCP1，CCP2，CCP3，CCP4和CCP5.采用高效凝膠色譜法，以系列已知相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定油茶餅粕多糖相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果見表2.

表2 各樣品相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試結(jié)果Tab.2 Assay results of relative molecular mass

采取PMP柱前衍生高效液相色譜法測(cè)得油茶餅粕多糖中單糖組成比例為：阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶甘露糖＝1∶0.367∶0.181∶0.126∶0.054∶0.037 3.

2.2 油茶餅粕多糖對(duì)大鼠小腸黏膜α－葡萄糖苷酶抑制效果測(cè)定與分析

從圖1可知，油茶餅粕粗多糖及各分級(jí)多糖的不同質(zhì)量濃度與其對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)正相關(guān)，IC50值見表3.說明油茶餅粕多糖對(duì)α－葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，且純化分級(jí)以后大部分分級(jí)多糖抑制效果較粗多糖更顯著.說明分級(jí)純化是必要的.這也表明油茶餅粕多糖具有一定的抑制糖吸收的功能，即可能具有一定的降血糖活性.結(jié)合表2結(jié)果分析：多糖的相對(duì)分子質(zhì)量為3 000～12 000，與已報(bào)道的其他物種中有較強(qiáng)活性多糖的相對(duì)分子質(zhì)量類似，證明具有活性的多糖相對(duì)分子質(zhì)量通常是較低的.由單糖組成分析結(jié)果可知油茶餅粕多糖的單糖構(gòu)成中阿拉伯糖比例最高，而阿拉伯糖是一種常見的抑制血糖升高的成分.因此，可推測(cè)油茶餅粕多糖對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制與此有密切關(guān)系.

圖1 不同樣品對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory activity curve of CCP onα－glucosidase

表3 不同油茶餅粕多糖樣品的IC50Tab.3 Results of IC50

2.3 結(jié)果與討論

油茶餅粕多糖中單糖組成比例為：阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶甘露糖＝1∶0.367∶0.181∶0.126∶0.054∶0.037 3.由單糖組成分析結(jié)果可知油茶餅粕多糖的單糖構(gòu)成中阿拉伯糖比例最高，而阿拉伯糖是一種常見的抑制血糖升高的成分.因此，可推測(cè)油茶餅粕多糖對(duì)α－葡萄糖苷酶活性抑制與此有密切關(guān)系.

經(jīng)體外活性檢測(cè)證實(shí)了油茶餅粕多糖具有抑制葡萄糖吸收的作用.油茶餅粕粗多糖及各分級(jí)多糖的不同質(zhì)量濃度與其對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)正相關(guān).純化分級(jí)以后的多糖抑制效果較粗多糖更顯著.

活性多糖的降血糖機(jī)制是多途徑、多靶點(diǎn)的，作者下一步將對(duì)油茶餅粕多糖降血糖的構(gòu)效關(guān)系以及機(jī)制開展研究.

致謝：感謝江南大學(xué)分析測(cè)試中心為本文多糖相對(duì)分子質(zhì)量及單糖組成的檢測(cè)提供條件.

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