許存賓， 劉 艷， 王錫鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

Wolbachia是一類細胞內(nèi)共生菌，是屬于α－變形菌門的立克次氏體。最早于1924年在尖音庫蚊（Culex pipiens Linnaeus）的生殖器官內(nèi)發(fā)現(xiàn)，命名為 Wolbachia pipienti［1］。Wolbachia 普遍寄生于昆蟲、甲殼動物、螨蟲和絲狀線蟲類動物體內(nèi)，據(jù)估計66%的昆蟲都感染有Wolbachia［2］。Wolbachia隨母系遺傳，參與調(diào)控寄主的誘導(dǎo)細胞質(zhì)不親和（cyto－plasmic incompatibility，CI）、雄性致死（male－killing）、雌性化（feminization）、孤雌生殖（parthenogenesis inducing）等多種生殖活動［3－7］，從而有利于自身的生存與傳播，并影響寄主的生殖行為。此外也有研究表明Wolbachia能保護寄主抵御病原菌和寄生蟲等的侵害［8］。Wolbachia還能依靠寄主的捕食、寄生等行為在昆蟲的個體、群體間進行橫向傳播［9－10］。

早期的研究多用DAPI染色法和電鏡觀察昆蟲體內(nèi)的 Wolbachia［11－12］。隨著分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展，主要利用其16S／23SrDNA、groEL、ftsZ和wsp等基因進行PCR檢測與序列分析［13］。編碼表面蛋白的Wolbachia outer surface protein（wsp）基因是已知的Wolbachia基因中進化最快的基因，因而被廣泛地用于Wolbachia的PCR檢測與分子鑒別［14］。根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)生，Wolbachia的不同種屬被劃分為11個超群（supergroups A～K），節(jié)肢動物中的Wolbachia主要劃分在A和B超群，并在兩超群下又細分為12個組［14］。

水稻是我國最重要的糧食作物之一，水稻生產(chǎn)的豐歉直接影響我國的糧食安全。自20世紀(jì)60年代中期起，稻田3種飛虱（褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱）陸續(xù)成為影響我國水稻生產(chǎn)的重要生物災(zāi)害。同時灰飛虱還可以在水稻、小麥、玉米上傳播水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒，引起的病毒病造成更為嚴(yán)重的損失［15］。長期以來國內(nèi)外把研究重點放在與應(yīng)急防治密切相關(guān)的技術(shù)研發(fā)上，而對與稻飛虱災(zāi)變和持續(xù)治理相關(guān)的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)研究較少。特別是灰飛虱與內(nèi)共生菌、病毒三者之間的相互關(guān)系的相關(guān)研究還未見報道。本研究的主要目的是檢測我國主要水稻產(chǎn)區(qū)灰飛虱攜帶的共生細菌Wolbachia比例，對其wsp基因進行序列測定與比較，為深入研究稻飛虱與其體內(nèi)共生物的關(guān)系，揭示W(wǎng)olbachia對共生昆蟲的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲源材料

本試驗所采用的灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallen）采集于我國12個省（自治區(qū)）21個水稻生產(chǎn)地區(qū)（見表1），采集時間為2010－2011年。田間活體采集并進行種類鑒定后，取部分樣品按采集地區(qū)隔離飼養(yǎng)，剩余樣品經(jīng)液氮冷凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA的提取

灰飛虱總DNA的提取采用Promega公司的Wizard Genomic DNA提取試劑盒，提取方法參考說明書略作改動。取冷凍保存單頭灰飛虱經(jīng)乙醇消毒清洗后，切取腹部組織于1.5mL離心管，加入液氮后用玻璃研棒充分研磨并加入50μL核酸裂解液（nuclei lysis solution）勻漿，直至組織完全破裂，再用100μL核酸裂解液沖洗研棒，混勻后65℃溫浴20min。室溫冷卻，加入1μL RNase，37℃溫浴20min，加入80μL蛋白質(zhì)沉淀劑（protein precipi－tation solution），振蕩混勻后冰浴5min，13 000～16 000r／min常溫離心6min。取上清于1.5mL離心管中，加入300mL常溫異丙醇，輕柔顛倒混勻，13 000～16 000r／min常溫離心3min，棄上清，加入75%乙醇，13 000～16 000r／min常溫離心2min，再加75%乙醇重復(fù)1次，超凈臺干燥后加入25μL ddH2O，65℃溫浴溶解1h，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

參照Zhou等方法［14］進行Wolbachia的wsp基因的PCR擴增，采取通用引物 wsp－81F：5′－TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC－3′；wsp－691R：5′－AAA AAT TAA ACG CTA CTC A－3′，引物由華大基因公司合成。擴增反應(yīng)液（25μL體系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴增程序進行：95℃預(yù)變性5min；95℃變性0.5min，55℃復(fù)性0.5min，72℃延伸1min，36次循環(huán)；最后在72℃延伸10min；4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)灰飛虱線粒體基因序列（GenBank登錄號：FJ360695），設(shè)計引物COI－F：5′－ATT TAC CCA CCA CTA TCT－3′；COI－R：5′－TGG AAA TGA GCC ACT ACA－3′用于PCR擴增灰飛虱的COI基因，片段長度為752bp。擴增反應(yīng)液（25μL體系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴增程序進行：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，51℃復(fù)性0.5min；72℃延伸1min，36次循環(huán)；最后在72℃延伸10min，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 擴增產(chǎn)物的電泳檢測

取PCR特異性擴增產(chǎn)物5μL，在1%的瓊脂糖膠上進行電泳檢測（電壓100V，30min），紫外燈下觀察結(jié)果并保存，明確Wolbachia的wsp基因與灰飛虱的COI基因是否存在以及擴增片段的大小。

1.5 Wolbachia的wsp基因片段克隆和測序分析

PCR產(chǎn)物純化后，連接至pMD－18T載體上，轉(zhuǎn)化到DH 5α大腸桿菌感受態(tài)中。每個樣品選取3個陽性克隆由華大基因公司進行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR檢測

對采集自全國12個省份（自治區(qū)）21個地區(qū)共167頭灰飛虱樣品進行Wolbachia測定，以灰飛虱COI為對照。其中16個地區(qū)的灰飛虱都100%感染有Wolbachia，5個地區(qū)出現(xiàn)非陽性個體，四川遂寧地區(qū)感染率最低，平均陽性率為96.41%（見表1）。

表1 不同地區(qū)灰飛虱感染W(wǎng)olbachia情況統(tǒng)計表

2.2 序列測定與分析

對167頭灰飛虱中的102頭的Wolbachia wsp進行了序列測定，獲得的wsp基因的序列長度均為599bp，各地理種群間序列僅存在極小的差異。21個地區(qū)群體中都具有相同的wsp序列個體，其中只有3個地區(qū)的個體中存在變異。云南大理（YNDL－1）樣品的46位存在突變T→C；四川郫縣（SCPX－2）樣品的231位存在突變A→G，云南保山（YNBS－6）樣品的584位存在一個gap。將全國大部分地區(qū)Wolbachia一樣的wsp序列命名為National－wsp，參照Zhou等［11］Wolbachia的分類，結(jié)合NCBI的blast工具，用MEGA v.5對上述序列進行聚類構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。

圖1 灰飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

從系統(tǒng)發(fā)育樹可以得出，灰飛虱體內(nèi)Wolbachia在系統(tǒng)進化上屬于B超群（supergroup B）內(nèi)Con組（Group Con）［14］。在地理區(qū)域上，國內(nèi)各地區(qū)以及日本、泰國等地的灰飛虱Wolbachia處于同一分支，不存在地理種群的分化。

圖2 灰飛虱COI基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 三種稻飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫，對比褐飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因（GenBank登錄號：GU289775，F(xiàn)J713754，F(xiàn)J713760，GU289751）序列和白背飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因（GenBank登錄號：GU361730，GU361731，GU361731，F(xiàn)J713766）序列。其中白背飛虱與灰飛虱的序列完全一致，但兩者與褐飛虱存在較大差異，序列相似性只有83.39%。由此我們假設(shè)白背飛虱與灰飛虱可能感染有相同的Wolbachia（圖3所示，B超群下Con組），而褐飛虱可能感染另外一個株系的Wolbachia（圖3所示，B超群下Cau組）。系統(tǒng)進化樹中與灰飛虱和白背飛虱處于同一分支的還有寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）、寄生螯蜂（Dryinid wasp），與之相近的還有一種寄生絨繭蜂［Cotesia glomerata（L.）］，這些寄生昆蟲可能幫助了灰飛虱與白背飛虱體內(nèi)Wolbachia在其種群內(nèi)和種群間進行水平傳播。但是3種稻飛虱在自然界具有密切交匯，那么三者體內(nèi)應(yīng)該攜帶相似的Wolbachia，然而三者中兩者一樣而另一種存在差異。

圖3 灰飛虱體內(nèi)Wolbachia與已報道的wsp基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

通過設(shè)計Wolbachia的wsp基因的特異引物，對采集自我國12個省21個地區(qū)的灰飛虱進行鑒定，發(fā)現(xiàn)我國絕大部分地區(qū)灰飛虱都帶有Wolbachia，且感染率高。不同地區(qū)灰飛虱Wolbachia的感染率存在一定的差異，四川地區(qū)的感染率較其他地方相對低，這與甘波誼等［16］的報道相一致。從群體分化來看，灰飛虱體內(nèi)的Wolbachia為同一群體，不存在明顯的地理種群分化，這可能與不同地區(qū)的灰飛虱群體可以經(jīng)常進行基因交流有關(guān)。

三種稻飛虱體內(nèi)的Wolbachia比較發(fā)現(xiàn)：灰飛虱與白背飛虱的wsp基因序列完全一致，而與褐飛虱存在較大差異。再次引起我們對Wolbachia如何在自然界進行傳播的思考。有報道推測可能與灰飛虱和白背飛虱的寄生蜂（Dryinid wasp）、寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）有關(guān)［10］，這兩種寄生昆蟲可能協(xié)助了Wolbachia在兩種飛虱之間的水平傳播。

三種稻飛虱在自然界具有極其相似的生活環(huán)境，寄生螯蜂（Dryinid wasp）和寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）同為三種稻飛虱的寄生昆蟲［16－17］，而從本研究得出的系統(tǒng)發(fā)育樹可以明顯看出Wolbachia在三者之間產(chǎn)生了種群分化。此外，從系統(tǒng)發(fā)育樹中還發(fā)現(xiàn)與灰飛虱、白背飛虱處于同一分支的還有雜擬谷盜（Tribolium confusumJacquelin du Val），一種鞘翅目擬步行蟲科昆蟲。與褐飛虱處于同一分支的還有鱗翅目的赤松毛蟲（Dendrolimus spectabilis Butler），寄生于赤松，與褐飛虱的生活習(xí)性及分布區(qū)域相差很大。怎樣的遺傳事件使不同的昆蟲具有相類似的Wolbachia，而相類似的昆蟲群體卻具有不同的Wolbachia？當(dāng)然，僅僅用wsp一個基因是不足以全面反映各宿主的Wolbachia種群的關(guān)系的，這只是一方面的推測。Wolbachia在自然界中真實的傳播方式還需要從多方位、多角度進一步探索。

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