李旭威，王海英，吳銳全，謝駿，郁二蒙，吳垠，余德光，王廣軍，龔?fù)麑?/p>

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023)

鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)是一種高度保守的分子伴侶蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中主要的鈣結(jié)合蛋白之一。Ostwald等[1]于1974年首次從骨骼肌肌漿網(wǎng)中提純得到鈣網(wǎng)蛋白，之后Fliegel等[2]和Smith等[3]同時獲得編碼這種蛋白的cDNA，并將此蛋白命名為高親和力Ca2+結(jié)合蛋白 (high affinity calcium binding protein，HACBP)。直到1991年，Opas等[4]發(fā)現(xiàn) HACBP是一種存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白，并將其重新命名為鈣網(wǎng)蛋白。

鈣網(wǎng)蛋白在細(xì)胞受到應(yīng)激如炎癥、熱休克、病毒感染時分泌到細(xì)胞外[5]，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。Asgari等[6]研究發(fā)現(xiàn)，菜粉蝶Pierisrapae血細(xì)胞表面的鈣網(wǎng)蛋白具有吞噬作用；在中國明對蝦Fenneropenaeuschinensis體內(nèi)注射白斑綜合征病毒(WSSV)6 h后，檢測發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)量顯著增加，結(jié)果證實了鈣網(wǎng)蛋白參與病毒侵襲后的免疫過程[7]。

鈣網(wǎng)蛋白位于大多數(shù)有核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，本身具有凝集素樣功能[8-9]，在結(jié)構(gòu)上亦與補(bǔ)體C1q受體類似，補(bǔ)體C1q能與鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合，啟動補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑。同時，吞噬細(xì)胞膜上的LDL受體相關(guān)蛋白(LDL—receptor related protein，LRP)可識別凋亡細(xì)胞上鈣網(wǎng)蛋白的功能受體。鈣網(wǎng)蛋白與LRP相互作用可活化吞噬細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號傳遞系統(tǒng)，啟動細(xì)胞的內(nèi)吞過程[10]。

鈣網(wǎng)蛋白基因目前已在斑馬魚Daniorerio、虹鱒Oncorhynchusmykiss[11]、牙鲆Paralichthysolivaceus、中國明對蝦Fenneropenaeuschinensis[12]、斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon[13]、斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus[14]中克隆獲得了鈣網(wǎng)蛋白基因序列，在虹鱒、斑點叉尾鮰的鈣網(wǎng)蛋白的研究中也初步了解了魚類鈣網(wǎng)蛋白的特性及其作用。Visudtiphole等[13]的研究表明，鈣網(wǎng)蛋白可作為斑節(jié)對蝦熱應(yīng)激的生物標(biāo)記物。

作為中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一的草魚Ctenopharyngodonidellus，在養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[15-16]。本試驗中，作者通過克隆和RACE技術(shù)獲得草魚鈣網(wǎng)蛋白基因全長，并研究了鈣網(wǎng)蛋白在草魚不同組織中的表達(dá)規(guī)律，以期為進(jìn)一步深入研究鈣網(wǎng)蛋白的功能以及在魚類免疫中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗草魚為3尾，購自黃沙水產(chǎn)品市場，體質(zhì)量為(1.451±0.352)kg。解剖后取肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟和脾臟，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol總RNA提取試劑盒購自Nitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD-19T載體、DL2000 DNA和Taq DNA聚合酶購自大連TaKaRa公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit和Advantage-2 PCR Kit均購自Clontech生物工程公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DH5α購自Tiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 RNA的提取參照Trizol說明書進(jìn)行，利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和質(zhì)量。按照TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒推薦的方法，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。具體步驟如下：取Oligo dT-接頭引物 1 μL、dNTP mixture 1 μL、總RNA 4 μL，加ddH2O至10 μL，于65 ℃下水浴5 min，然后在冰上急速冷卻；取該反應(yīng)液10 μL、5×PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、PrimeScript I RTase 1 μL，用RNase Free ddH2O加至20 μL。在PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng)：42 ℃下變性30 min，99 ℃下退火5 min，5 ℃下延伸 5 min。

1.2.2 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA核心序列克隆 根據(jù)GenBank中斑馬魚、虹鱒、小家鼠、人的鈣網(wǎng)蛋白基因mRNA序列設(shè)計并合成1對簡并引物——P1和P2(表1)，產(chǎn)物預(yù)計長度為495 bp。以草魚肌肉的cDNA為模板， 采用PCR擴(kuò)增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括ddH2O 19.8 μL、Buffer(含MgCl2) 2.5 μL、dNTP Mix 1 μL、cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性1 min，49 ℃ 下退火30 s，72 ℃下延伸 1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收后，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性克隆，最后通過PCR反應(yīng)檢測得到陽性克隆，陽性克隆由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，所得cDNA片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行Blast同源性分析。

表1 試驗用引物序列

1.2.3 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA 3′RACE的克隆 3′RACE的操作按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒方法進(jìn)行。首先以試劑盒提供的Oligo dT-Adaptor primer為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用上述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、5×PCR Buffer 10 μL、ddH2O 28.75 μL、TaKaRa Ex Taq?HS 0.25 μL、上游特異性引物P3(表1)0.5 μL和M13 Primer M4 0.5 μL進(jìn)行首次PCR反應(yīng)。具體反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個循環(huán)。巢式PCR所用引物為M13 Primer M4和P4(表1)。PCR產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并回收、克隆后測序。

1.2.4 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA 5′RACE的克隆 根據(jù)克隆得到的草魚鈣網(wǎng)蛋白基因的cDNA核心片段，以SMARTTMRACE cDNA Amp lification Kit (Clotech)引物設(shè)計原則，設(shè)計2個下游引物P5與P6(表1)，上游引物由試劑盒提供。5′RACE cDNA合成用試劑盒提供的5′-CDS Primer A與SMART II A Oligo引物。取總RNA 2 μL，合成5′RACE cDNA方法按照試劑盒說明進(jìn)行。得到5′RACE cDNA后進(jìn)行首次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃下變性30 s，65 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸 3 min，共進(jìn)行25個循環(huán)。取首次擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入245 μL的Tricine-EDTA buffer，然后取5 μL作為巢式PCR的cDNA。擴(kuò)增條件為：94 ℃下預(yù)變性30 s，65 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行20個循環(huán)。RACE產(chǎn)物純化、克隆和測序方法同上。

1.3 鈣網(wǎng)蛋白基因的氨基酸序列相似性分析

用NCBI中Blast軟件將獲得的cDNA序列進(jìn)行拼接，得到鈣網(wǎng)蛋白基因的全長cDNA序列。用Vector 8.0程序搜索開放閱讀框并預(yù)測氨基酸序列，采用ClustalX 1.83 對不同物種的鈣網(wǎng)蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行比對，然后用Mega 3.1軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。

1.4 不同組織中Ci-CRT的表達(dá)

用“1.2”中的方法得到不同組織的cDNA模板，根據(jù)目的基因的全長cDNA序列，設(shè)計1對RT-PCR特異引物P7與P8(表1)，以草魚的β-actin基因序列設(shè)計內(nèi)參引物P9與P10(表1)。PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，49 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行32個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鈣網(wǎng)蛋白基因全長cDNA序列的特征分析

草魚鈣網(wǎng)蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Vector NTI Suite 8.0軟件包中的Contig Express程序進(jìn)行重復(fù)序列的識別和拼接，得到鈣網(wǎng)蛋白全長cDNA為1 389 bp，包含1 263 bp的開放閱讀框，編碼為421個氨基酸，長度為69 bp的5′UTR和長度為57 bp的3′UTR。利用ProtParam程序(http://www.expasy. org/)對氨基酸序列進(jìn)行基本的物理化學(xué)性質(zhì)分析，預(yù)測該蛋白的相對分子質(zhì)量為48 700，理論等電點為4.33。經(jīng)SignalP軟件預(yù)測，氨基酸N-端是由21個氨基酸殘基構(gòu)成的疏水信號肽( MQIITLFPFVSAALLALAANA )，且發(fā)現(xiàn)兩個保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽(KHEQKIDCGGGYVKVF與IMFGPDICG)，以及另外兩個鈣網(wǎng)蛋白家族保守重復(fù)序列A和B(PXXIXDPDAXKPEDWDE與GXWXPPXIXNPXYX)(圖1)。

2.2 序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

選擇哺乳類、魚類、蝦蟹類、昆蟲等物種的鈣網(wǎng)蛋白的氨基酸序列(圖2)進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草魚鈣網(wǎng)蛋白基因功能域具有較高的保守性，在C-端都有保守K/HDEL標(biāo)簽，且氨基酸序列與斑馬魚(NM_131047.1)、虹鱒(NM_001124478.1)的相似性分別為86.26%、76.78%，與中國明對蝦(DQ323054.1)的相似性為63.83%，與人(BT007448.1)、牛(BC140582.1)、果蠅(NP_524293)和小家鼠(NM_007591.3)的相似性分別為69.67%、70.38%、62.17%和69.19%。

對鈣網(wǎng)蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，構(gòu)建的進(jìn)化樹與傳統(tǒng)的生物界的劃分比較一致。構(gòu)建的分子進(jìn)化樹可以簡單的將基因聚類為植物、脊椎動物和無脊椎動物。已獲得的草魚鈣網(wǎng)蛋白核苷酸序列與小家鼠、人、牛、非洲爪蟾、其它的魚類聚為一類；家蠶、果蠅與中國明對蝦、太平洋牡蠣等無脊椎動物聚為一類；而小麥等植物位于進(jìn)化樹的最下方(圖3)。

2.3 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因的組織表達(dá)

通過半定量RT-PCR分析顯示，鈣網(wǎng)蛋白基因在草魚的肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟和脾臟中均有表達(dá)(圖4)。以鈣網(wǎng)蛋白基因與β-actin電泳帶吸光度的比值繪制了鈣網(wǎng)蛋白在草魚各組織的表達(dá)相對豐度(圖5)。從圖5可見：鈣網(wǎng)蛋白基因在肝胰臟、鰭條的表達(dá)量均較高，顯著高于肌肉、腸道、鰓、腎臟、脾臟(P<0.05),但與皮膚無顯著差異(P>0.05)；鈣網(wǎng)蛋白基因在皮膚中的表達(dá)量次之。

3 討論

鈣網(wǎng)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上主要的Ca2+結(jié)合蛋白，具有調(diào)控細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存功能的作用，并且參與細(xì)胞黏附、傷口愈合、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與病理變化等過程[17-18]。隨著對鈣網(wǎng)蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)人類和小家鼠還具有不同基因型(2型鈣網(wǎng)蛋白基因，calreticulin-2)，在大鼠、牛中也相繼發(fā)現(xiàn)2型鈣網(wǎng)蛋白基因[19]。本研究中的草魚鈣網(wǎng)蛋白基因是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中虹鱒、牙鲆、斑馬魚等的鈣網(wǎng)蛋白序列設(shè)計的簡并引物克隆獲得的，基因全長為1 389 bp，由基因推導(dǎo)的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上與哺乳類的鈣網(wǎng)蛋白一樣，分為N-、P-和C- 3個功能域。經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)，其與斑馬魚、虹鱒具有較高的同源性，序列含有兩個高度保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽(KHEQKIDCGGGYVKVF 100～116和IMFGPDICG 132～140)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收信號四肽(H/KDEL)區(qū)域[20]。而所知的人類和小家鼠的calreticulin-2與calreticulin相比，其在C末端只具有-EL區(qū)域，而不具有鈣網(wǎng)蛋白的回收信號四肽序列[19]。由此推知，本試驗中從肝胰臟克隆的基因應(yīng)為草魚calreticulin。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)，斑點叉尾鮰鈣網(wǎng)蛋白具有calreticulin和calreticulin-like 2。草魚鈣網(wǎng)蛋白是否存在不同的基因型還有待進(jìn)一步研究。

注：雙下劃線表示信號肽，方框表示兩個保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽，粗體下劃線表示重復(fù)序列，星號表示終止密碼子。Note:The predicted signal peptide is indicated with double underlined,CRT family signature motifs are boxed, repeat sequences are indicated with underlined bold text, and stop codon is indicated by asterisk.圖1 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of full-length Calreticulin(CRT) cDNA in grass carp

本試驗中，利用RT-PCR方法檢測鈣網(wǎng)蛋白在草魚肝胰臟、脾、腸道、鰓、肌肉、鰭條、皮膚、腎臟中的表達(dá)分布情況，結(jié)果表明，在草魚的8個組織器官中均可檢測到鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，其中在肝肝胰臟和鰭條中的表達(dá)量較高,且兩者表達(dá)量都高于其它6個組織。Kales等[11]研究了虹鱒的鈣網(wǎng)蛋白，在虹鱒的肌肉、頭腎、肝胰臟、中腎、鰓、脾臟、心臟、腦和腸道中均檢測到其表達(dá)，其中在肝胰臟中的表達(dá)量高于其它組織，這與本試驗結(jié)果相一致。在Liu等[14]的研究中，選取斑點叉尾鮰的脾臟、肌肉、中腎、頭腎、腦、心臟、鰓、胃、腸道和皮膚10個組織器官進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，鈣網(wǎng)蛋白在各組織中均能表達(dá)，亦發(fā)現(xiàn)其在肝胰臟中的表達(dá)量較高。肝胰臟作為免疫系統(tǒng)中的重要器官，由于其中存在大量的巨噬細(xì)胞等先天性免疫組分，在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、修復(fù)損傷中發(fā)揮重要作用，許多抗病毒相關(guān)基因在肝胰臟中的表達(dá)量都較高[21]。

在體外試驗中，鈣網(wǎng)蛋白與HSP70、HSP90、gb96一樣能夠直接激活免疫細(xì)胞[22]。鈣網(wǎng)蛋白在應(yīng)激狀態(tài)下也會發(fā)生變化，如鈣網(wǎng)蛋白在熱應(yīng)激情況下，為了維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其表達(dá)呈上調(diào)的趨勢，而在低氧、缺氧的情況下，鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)也都呈上調(diào)趨勢[23-24]。草魚是中國淡水池塘養(yǎng)殖的主要種類之一，在養(yǎng)殖過程中，草魚的發(fā)病率高且難治愈。鑒于鈣網(wǎng)蛋白在免疫和應(yīng)激方面存在的潛在作用，加強(qiáng)對草魚鈣網(wǎng)蛋白功能的進(jìn)一步研究是十分必要的。

注：人Homo sapiens(BT007448.1)，小家鼠Mus musculus(NM_007591.3),牛Bos taurus(BC140582.1),果蠅Drosophila melano gaster(NM_079569.4),中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis(DQ323054.1),草魚Ctenopharyngodon idellus, 斑馬魚Danio rerio(NM_131047.1),虹鱒Oncorhynchus mykiss(NM_001124478.1)。圖2 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因氨基酸序列的比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of Calreticulin (CRT) in grass carp

圖3 鈣網(wǎng)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Calreticulin (CRT)

注：M為DL 2000 marker；1～8、9～16、17～24為3組重復(fù)，依次對應(yīng)肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟、脾臟。Note:M,DL 2000 marker;1-8,9-16,17-24 triplication;1,muscle;2,intestine; 3,hepatopancreas; 4,gill; 5,skin; 6,ray; 7,kidney; 8, spleen.圖4 Calreticulin mRNA 在草魚不同組織中的表達(dá)電泳圖譜Fig.4 Expression of Calreticulin mRNA in different tissues of grass carp by RT-PCR

圖5 Calreticulin mRNA在草魚不同組織中表達(dá)量的分析Fig.5 The significance tests of Calreticulin mRNA expression in different tissues of grass carp

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