劉梅雪，歐陽五慶，吳敬超，宋 冰，芮 弦

（西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌712100）

特比萘芬是廣譜抗真菌新一代丙烯胺類藥物，其作用機制是通過高選擇性抑制真菌細胞膜內(nèi)麥角甾醇合成過程中的角鯊烯環(huán)氧化酶使鯊烯積聚而產(chǎn)生殺菌作用，其抗菌譜廣，抗菌作用強，作用持久且毒性低［1］。納米乳是由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑以適當比例混合形成的一種透明或半透明、低黏度的動力學和熱力學穩(wěn)定體系，其粒徑一般介于1～100nm之間［2］。納米乳作為極具潛力的新型藥物載體，具有其他藥物載體不可比擬的優(yōu)點，如增強藥效、提高藥物生物利用度、緩釋靶向和透皮性好等優(yōu)點［3］。近年來，透皮吸收制劑的應用開發(fā)越來越多，而納米乳因其特有的理化性質(zhì)，在透皮吸收制劑的研究方面受到了極大的關注。

在皮膚真菌病中，由于真菌菌絲可侵入角質(zhì)層深部，因此，抗真菌藥物中表皮給藥劑型的療效與其經(jīng)皮滲透能力有關。本試驗以小鼠皮膚為模型，應用改良的Franz立式擴散池，對受試動物復方特比萘芬納米乳進行了體外經(jīng)皮透過性評價，考察了其主藥特比萘芬的經(jīng)皮滲透性［4］，并通過皮膚刺激性試驗、皮膚急性毒性試驗和皮膚過敏試驗對復方特比萘芬納米乳進行安全性評價，以期為獸醫(yī)臨床安全給藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要藥品與試劑 特比萘芬，購自大連美侖生物技術有限公司；肉豆蔻酸異丙酯，購自浙江物美化學品有限公司；吐溫－80，購自天津市恒星化學試劑制造有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑如醋酸銨、磷酸二氫銨等均為國產(chǎn)分析純。

1．2 試驗動物 健康家兔70只，體重約在2．0～2．5kg之間；白色豚鼠30只，體重約在250～300g之間；昆明系小鼠6只，體重在20～22g之間，均購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1．3 主要儀器 UV－2450紫外－可見分光光度計（日本島津公司）；Hitachi高效液相色譜儀配紫外檢測器（日本 Hitachi公司）；HC－188透皮擴散儀（天津市正通科技有限公司）；Diamonsil C18柱、電子天平及AS－3120超聲儀等。

1．4 復方特比萘芬納米乳及空白納米乳的制備

1．4．1 復方特比萘芬納米乳的制備 室溫下，按配方量將特比萘芬及其復方成分溶于肉豆蔻酸異丙酯（IPM）中，然后加入無水乙醇使其全部溶解，再加入吐溫－80攪拌均勻，最后邊攪拌邊滴加配方量的蒸餾水，即可制備出復方特比萘芬納米乳。

1．4．2 空白納米乳的制備 室溫下，按配方量將肉豆蔻酸異丙酯加入無水乙醇中使其全部溶解，再加入吐溫－80攪拌均勻，最后邊攪拌邊滴加配方量的蒸餾水，即可制備出空白納米乳。

1．5 皮膚刺激性試驗

1．5．1 動物分組 選擇健康家兔36只（單次給藥皮膚刺激性試驗和多次給藥皮膚刺激性試驗各18只），隨機分為生理鹽水組、空白納米乳組和復方特比萘芬納米乳組，每組6只（完整皮膚和破損皮膚各3只）。

1．5．2 試驗動物的處理 將上述已分好組別的家兔于給藥前24h，用剪毛剪除去脊柱兩側被毛，然后均勻涂抹脫毛劑，2min后，用干棉球沾溫水將脫毛劑和脫落的被毛一并洗干凈，去毛面積約150 cm2。去毛24h后檢查去毛部位皮膚是否有損傷，以無紅斑、水腫及破損為佳。破損皮膚組需建立損傷皮膚模型，方法是用無菌針頭在脫毛區(qū)皮膚上劃“井”字，以劃破表皮滲血為宜，并控制左右兩側皮膚的破損程度基本保持一致。

1．5．3 單次給藥皮膚刺激性試驗 采用左右側自身對比，左側脫毛區(qū)按0．5mL／只涂復方特比萘芬納米乳，右側不涂抹作對照，用雙層紗布覆蓋，膠布固定，每只家兔單籠飼養(yǎng)。給藥24h后，用溫水清洗涂抹部位，去除殘留藥物，觀察記錄去除藥物后1、24、48h和72h時涂抹部位有無紅斑和水腫反應。涂抹部位依據(jù)皮膚刺激性反應評分標準［5］進行皮膚刺激反應評分，并計算其刺激分值。刺激分值＝（紅斑反應總分＋水腫反應總分）／每組動物數(shù)，生理鹽水組、空白納米乳組試驗方法同復方特比萘芬納米乳組。

1．5．4 多次給藥皮膚刺激性試驗 采用左右側自身對比，左側脫毛區(qū)按0．5mL／只涂復方特比萘芬納米乳，右側不涂抹作對照，并用雙層紗布覆蓋，膠布固定。每只家兔單籠飼養(yǎng)，每天定時涂抹給藥1次，連續(xù)涂抹7d。在每次去除藥物后1h，觀察記錄涂抹部位有無紅斑和水腫反應，并進行評分，計算每天每只動物平均積分，判定皮膚刺激性強度。生理鹽水組、空白納米乳組試驗方法同復方特比萘芬納米乳組。

1．6 皮膚急性毒性試驗

1．6．1 動物分組 選擇健康家兔32只，隨機分為4組，分別為生理鹽水組，空白納米乳組、1%復方特比萘芬納米乳組、2%復方特比萘芬納米乳組，每組8只（完整皮膚和破損皮膚各4只）。

1．6．2 試驗動物的處理 將上述已分好組別的家兔于給藥前24h脫毛，每組用4只家兔進行完整皮膚刺激性試驗，另4只建立損傷皮膚模型，方法同1．5．2項。

1．6．3 方法 對照組涂生理鹽水，其余3組分別在脫毛區(qū)及劃破皮膚區(qū)涂敷各自濃度的藥物（0．5 mL／只），用雙層紗布覆蓋，膠布固定，每只家兔單籠飼養(yǎng)。給藥24h后，用溫水清洗涂抹部位，去除殘留藥物，每日觀察，連續(xù)7d，觀察家兔皮膚、眼、黏膜及呼吸、活動等情況，并在給藥后第3天、第5天和第7天稱取家兔體重。

1．7 皮膚過敏性試驗

1．7．1 動物分組 將豚鼠隨即分成3組，每組10只。第1組涂抹1%復方特比萘芬納米乳，第2組為空白納米乳，第3組為2，4－二硝基氯代苯。

1．7．2 試驗動物的處理 試驗前24h用脫毛膏在豚鼠頸背部脊柱兩側3cm范圍內(nèi)脫毛。

1．7．3 致敏接觸 取0．2mL 1%復方特比萘芬納米乳涂于濾紙上，將其貼敷在左側脫毛區(qū)，兩層紗布一層油紙覆蓋，再用無刺激的膠布密封固定6h。第7天和第14天在背部同一區(qū)域以同樣的方式操作。

1．7．4 激發(fā)接觸 末次致敏后14d，以相同的方法將復方特比萘芬納米乳貼敷在豚鼠右側脫毛區(qū)，6h后去除貼敷物，即刻觀察，并于24、48、72h再次觀察皮膚過敏反應情況，皮膚過敏反應評分標準按文獻［4］評定（空白納米乳與2，4－二硝基氯代苯試驗方法同復方特比萘芬納米乳）。

1．8 特比萘芬分析方法的建立

1．8．1 色譜條件的選擇 色譜柱 Diamonsil C18 5μm 250×4．6mm；流動相：甲醇－0．05mol／L醋酸銨緩沖液溶液（80∶20）；檢測波長：282nm；流速為1．2mL／min；柱溫：室溫；進樣量：20μL。

1．8．2 標準曲線的建立 用流動相稀釋特比萘芬對照品溶液，精密配制濃度分別為10、15、20、25、30 μg／mL的特比萘芬對照品系列溶液，按上述色譜條件進樣測定，以對照品藥物濃度（x）對色譜峰面積（y）進行線性回歸。

1．8．3 回收率試驗 精密量取特比萘芬對照品溶液適量，置10mL容量瓶中，加入空白納米乳定容至刻度，用流動相配制成濃度分別為20μg／mL、25 μg／mL、30μg／mL的待測溶液進行測定，每個濃度重復進樣3次，將測定的峰面積值代入標準曲線方程，計算出實測濃度，并計算其回收率、平均回收率和相對標準偏差（RSD）。

1．9 透皮試驗

1．9．1 離體鼠皮的制備 將小鼠處死，用脫毛劑脫毛，剝離腹部皮膚，小心刮去皮下脂肪和粘連物，用生理鹽水沖洗干凈，冷凍保存，待用。

1．9．2 透皮方法 將小鼠腹部皮膚固定在Franz擴散池的2個半池之間，溫度為37℃，轉速為轉速為600r／min。接受液為pH值7．4的磷酸鹽緩沖液。取1mL復方特比萘芬納米乳適量均勻涂布予皮膚表明，分別于0．25、0．5、1、1．5、2、3、4、6、8、10、12h取樣1mL（同時補充等量同溫接收液），用0．45μm微孔濾膜過濾，用1．8項所建立的特比萘芬含量測定方法進行測定。按下式計算單位面積透皮量（Qn），并計算穩(wěn)態(tài)透皮速率（J）［μg／（cm2）·h］［6］。對照組為藥物的飽和溶液組，試驗方法同復方特比萘芬納米乳。

其中，Cn為第n個取樣點測得的藥物濃度（μg／mL）；V為接收液體積（5mL）；Ci為第i個取樣點測得的藥物濃度（μg／mL）；Vi為取樣體積（1mL）；A為滲透面積（0．758cm2）。以單位面積累計滲透量為縱坐標，時間為橫坐標，進行回歸，所得直線的斜率為穩(wěn)態(tài)透皮速率J。

2 結果與分析

2．1 皮膚刺激試驗 在對家兔單次給藥皮膚刺激性試驗中，復方特比萘芬納米乳和空白納米乳對完整皮膚，均未引起紅斑和水腫刺激反應，各觀察時間點的刺激分值均為0，屬無刺激性；復方特比萘芬納米乳和空白納米乳對破損皮膚，在觀察時間點1h時，刺激分值均為0．5，屬溫和的輕度刺激性，1h后的刺激分值均小于0．5，屬無刺激性。復方特比萘芬納米乳和空白納米乳對完整皮膚多次給藥，均未引起紅斑和水腫刺激反應，每天每只動物的平均刺激分值均為0，屬無刺激性；復方特比萘芬納米乳和空白納米乳對破損皮膚多次給藥時，均未引起水腫刺激反應，在前4d每天每只動物的平均刺激分值在0．50～0．65之間，屬輕度刺激性；5d后其平均刺激分值均小于0．5，屬無刺激性；試驗結束時，計算得到的每天每只動物平均刺激分值均為0．3，屬無刺激性。

2．2 皮膚急性毒性試驗 在皮膚急性毒性試驗中，各試驗組中家兔均未出現(xiàn)異常反應和死亡，其采食、體質(zhì)量、脫毛區(qū)皮膚、眼睛結膜、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動均未見明顯異常。初步認為復方特比萘芬納米乳對家兔正常生長無明顯的影響，外用安全低毒。試驗中家兔體質(zhì)量增長情況見表1。

表1 不同濃度復方特比萘芬納米乳皮膚急性中毒對家兔體重的影響 （±SD，n＝8）

表1 不同濃度復方特比萘芬納米乳皮膚急性中毒對家兔體重的影響 （±SD，n＝8）

組別 試驗前體重（kg）試驗后體重（kg）第3天 第5天 第7天1%復方特比萘芬納米乳2．12±0．12 2．21±0．10 2．28±0．12 2．34±0．11 2%復方特比萘芬納米乳 2．12±0．20 2．22±0．19 2．29±0．20 2．34±0．20空白納米乳組 2．05±0．21 2．16±0．22 2．20±0．21 2．26±0．22生理鹽水組2．14±0．19 2．24±0．20 2．29±0．19 2．36±0．20

2．3 皮膚過敏試驗 在皮膚過敏試驗中，2，4－二硝基氯代苯陽性對照組致敏發(fā)生率為100%，而復方特比萘芬納米乳和空白納米乳的皮膚過敏反應評分值為零，屬弱致敏物。

2．4 復方特比萘芬納米乳中特比萘芬含量的測定方法 通過線性回歸求得特比萘芬的標準曲線方程為y＝20 922x＋8 320．2，R2＝0．995 1（見圖1），特比萘芬在1～15μg／mL檢測濃度范圍內(nèi)線性關系良好。加樣回收率試驗結果表明，特比萘芬的平均回收率為（98．80±1．55）%，RSD為1．57%，表明測定方法的準確度高。

2．5 透皮試驗 經(jīng)回歸得到復方特比萘芬納米乳中特比萘芬的Qn方程為y＝0．840 3x＋0．191 6（r＝0．979），其透皮速率為0．840 3μg／cm·h。特比萘芬飽和溶液的Qn方程為y＝0．266 8x－0．155 5（r＝0．981），透皮速率為0．2668μg／cm·h。復方特比萘芬納米乳中特比萘芬與其飽和溶液相比，透皮速率增加將近4倍，說明納米乳促進了特比萘芬的透皮吸收（圖2，3）。

圖1 特比萘芬的標準曲線

圖2 特比萘芬對照品及復方特比萘芬納米乳樣品色譜圖

圖3 累計滲透量－時間曲線

3 討論

藥物安全性評價是為評價藥物的安全性，在實驗室條件下，用試驗系統(tǒng)進行的各種毒性試驗。它是新藥研發(fā)的必需組成部分，其目的在于了解藥物單次或短時間多次給藥后，動物所產(chǎn)生的毒性反應及其嚴重程度，為臨床安全用藥及監(jiān)測提供一定的參考，并對判斷一種藥物能否進入臨床研究，預測臨床研究的風險程度，為臨床研究提供重要的安全性依據(jù)。本研究結果顯示，復方特比萘芬納米乳在皮膚刺激性試驗、皮膚急性毒性試驗和皮膚過敏性試驗中，對家兔完整皮膚和破損皮膚無明顯刺激反應，對豚鼠無皮膚過敏反應，對家兔無明顯急性毒性反應，說明本制劑毒性甚小，是一種安全性較好的外用制劑。

納米乳制劑促進特比萘芬經(jīng)皮滲透的作用可能與以下兩方面因素有關：一是納米乳劑型本身有促進藥物透皮吸收的特點［7－8］；二是納米乳的組成成分有促透作用，復方特比萘芬納米乳的組成成分包括IPM，IPM本身就是一種常用的滲透促進劑［9］。

本研究對復方特比萘芬納米乳進行了安全性及透皮能力的考察，為其臨床應用提供了理論依據(jù)。由于本制劑是特比萘芬的一種全新藥物劑型，因此需進行全面的臨床療效驗證，考察其治療疾病效果，期望為獸醫(yī)臨床提供一種安全可靠、高效的治療皮膚病的新型納米藥物。

［1］ 安惠霞，斯拉普·艾白，古麗娜·達吾提，等．特比萘芬的抗菌作用及機制的研究［J］．中國抗生素雜志，2010，35（6）：479－483．

［2］ 李紅磊，張忠義，馬蕾蕾，等．丹參酮微乳的制備及大鼠在體腸吸收［J］．中國中藥雜志，2007，32（11）：1024－1027．

［3］ Wu W ，Wang Y ，Que L．Enhanced bioavailability of silymarin by self－microemulsifying drug delivery system ［J］．Eur J Pharm Biopharm ，2006，63（3）：288－294．

［4］ 王 晶，郭俊生，王曉黎．微乳系統(tǒng)在透皮給藥中的應用［J］．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（10）：739－742．

［5］ 劉昌孝．藥物評價學［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2005：255－257．

［6］ 劉梅，王慶偉，劉雪英，等．八角茴香揮發(fā)油經(jīng)皮滲透性及對布洛芬透皮吸收的影響［J］．醫(yī)藥導報，2011，30（3）：294－295．

［7］ 張陽德．納米藥物學［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2005：163－188．

［8］ 徐輝碧．納米醫(yī)藥［M］．北京：清華大學出版社，2004：77－97．

［9］ 朱盛山．藥物新劑型［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2003：69．