王忠山，秦海燕，唐立輝，董巖，盧 帥，杜 靜，趙銥民

(1.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院，陜西西安710032;2.解放軍第454醫(yī)院口腔科，江蘇南京210002)

鈦因其具有良好的生物相容性、機械性以及耐腐蝕性而被大量用作人體種植體材料。但是鈦的物理性能和化學成分都與人體組織相距甚遠，不能與骨組織和纖維軟組織形成化學鍵性的結(jié)合，特別是種植體經(jīng)皮段，如果不能與皮膚形成牢固的結(jié)合則會造成細菌輕易的入侵以及上皮的下行，最終導致種植體的失敗［1］。經(jīng)皮種植體植入成功并獲得持久的穩(wěn)定性主要依賴于種植體經(jīng)皮部軟組織良好的生物學封閉［2］。大量體外實驗證實種植體表面經(jīng)過不同處理會影響成纖維細胞的粘附、增殖，從而促進生物封閉的形成［3］。

從紫貽貝(Mytilus edulis)提取的貽貝足絲蛋白能夠在水環(huán)境中粘附到多種基體上，該蛋白具有良好的生物相容性，且無種屬特異性［4］。商品化貽貝蛋白試劑BD CELL－TAKTM已成功用于細胞培養(yǎng)、免疫組化、原位雜交技術(shù)等方面［5－6］。本研究通過將兩種具有細胞粘附作用的貽貝蛋白提取物Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被鈦表面后，觀察該蛋白對真皮成纖維細胞粘附和增殖的影響，研究其能否用做經(jīng)皮種植體表面處理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

直徑15 mm純鈦棒(TA2，西北有色金屬研究院);碳化硅砂紙(SAIL BRAND);貽貝足絲蛋白提取物Usun－afix(江蘇省江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司);BD CELL－TAKTM(BD Biosciences，美國);小兒包皮(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科提供);α－MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(GIBCO，美國);2.5 g/L胰酶、MTT試劑盒(碧云天，上海);DMSO(Sigma，美國);研磨拋光機(UNIPOL－830，沈陽科晶設(shè)備制造有限公司);日立S－4800掃描電鏡(HITACHI，日本);KJ－201A 型振蕩器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司);Synergy HT酶標儀(BioTek，美國)。

1.2 鈦片樣本的制備

將直徑15 mm的純鈦棒切成厚度1.5 mm的鈦片，分別用 240、400、600、800、1 000、1 200、1 500目的碳化硅砂紙在流水沖洗下打磨光滑;依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗30 min，吹干，封裝，Co60照射，即為光滑鈦片。在超凈臺內(nèi)將滅菌后的光滑鈦片放置在24孔板內(nèi)，每孔一片，并分為兩組，按產(chǎn)品使用說明，在兩組鈦片表面分別滴加 Usun－afix、CELL－TAKTM貽貝蛋白，每片 30 μL，涂布均勻后室溫靜置20 min(乙酸溶劑揮發(fā)后蛋白即自動吸附到鈦片表面)，無菌去離子水沖洗3次，制成兩種貽貝足絲蛋白 Usun－afix、BD CELL－TAKTM包被鈦片組，4℃暫存。

1.3 鈦片樣本表面形貌觀察和化學組成分析

隨機抽取光滑鈦片以及Usun－afix、CELL－TAKTM貽貝蛋白包被鈦片各3片，CO2臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察鈦片表面的形態(tài);再從上述3組鈦片中各隨機抽取3片，利用X射線能量色散譜(Energy dispersive X－ray spectroscopy，EDS)分析樣品表面存在的元素種類，從而確定貽貝蛋白存在于樣本表面。

1.4 人真皮成纖維細胞培養(yǎng)及其在3組鈦片樣本表面粘附和增殖效果觀察

1.4.1 人真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)

取小兒包皮術(shù)后切除的多余皮膚組織，放入無菌PBS緩沖液中。然后用2.5 g/L的Dispase酶Ⅱ在37℃下處理25 min后，剝除表皮，取真皮用無菌剪刀剪碎，放入含2.5 g/L的膠原酶和2.5 g/L的Dispase酶Ⅱ的溶液中，37℃攪拌2 h，用200目金屬濾網(wǎng)過濾，10 mL/L胎牛血清的 PBS洗滌，1 200 r/min離心10 min，棄上清。最后將成纖維細胞以2×104/cm2密度接種到含有100 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L－谷氨酰胺、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的α－MEM培養(yǎng)基中，標準環(huán)境中培養(yǎng)。24 h內(nèi)細胞貼壁完成，4 d后細胞長滿，常規(guī)胰酶消化傳代，取第3代的細胞用于實驗。

1.4.2 人真皮成纖維細胞在3組鈦片樣本表面的增殖效果

取光滑鈦片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM兩種貽貝蛋白包被鈦片各12片，分別放入24孔板孔內(nèi)，每孔一片。取生長良好的P3代真皮成纖維細胞2.5 g/L胰酶消化后，以1×104/孔的密度接種于鈦片表面，加入含 100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的α－MEM培養(yǎng)液，標準條件下培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1、3、5 d各時間點時，每組各隨機抽取4孔，吸出培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入5 mg/mL的MTT液200 μL，培養(yǎng)液800 μL，繼續(xù)孵育。4 h后，終止培養(yǎng)，吸除上清液，加入600 μL DMSO，震蕩10 min，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)甲瓚全部溶解(全過程避光進行)后每孔吸取4份150 μL溶解液，轉(zhuǎn)移至96孔板中，酶標儀在490 nm波長下測定吸光度值(OD)，取平均值。同時設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液平行孔，用于比色時的吸光度值調(diào)零。

1.4.3 人真皮成纖維細胞在3組鈦片樣本表面的粘附效果

1.4.3.1 DiI－AcLDL 染色熒光顯微鏡下觀察

取1T25瓶P3代真皮成纖維細胞，2.5 g/L胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，棄上清。用不含血清的 α－MEM培養(yǎng)基將 DiI－AcLDL稀釋至10 μg/mL配制的熒光染液，并以5 mL重懸細胞，37℃避光孵育4 h，去培養(yǎng)液，PBS洗2次，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后確定為標記成功。然后取光滑鈦片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM兩種貽貝蛋白包被鈦片各5片，分別放入24孔板孔內(nèi)，將已標記成功的成纖維細胞以105/孔的密度接種于各鈦片樣本表面，在標準環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)15、30 min和 1、2、4 h后，取各組細胞，吸棄培養(yǎng)液，PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)洗3 次，置熒光顯微鏡下觀察，每組各隨機選取1個區(qū)域拍攝照片。

1.4.3.2 MTT 法檢測粘附效果

取光滑鈦片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM兩種貽貝蛋白包被鈦片各15片，分別放入24孔板孔內(nèi)。取P3代成纖維細胞胰酶消化、計數(shù)后，以2×105/孔密度接種于各鈦片表面，加入α－MEM培養(yǎng)液(不含血清)標準條件下培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后15、30 min和1、2、4 h各時間點，每組各隨機抽取3孔吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，用MTT法檢測剩余貼壁細胞吸光度值，具體方法同1.4.2。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 3種鈦片樣本表面微形貌觀察和化學組成分析

用掃描電鏡對3種鈦表面進行觀察發(fā)現(xiàn)拋光鈦表面無特殊結(jié)構(gòu)(圖1a)。經(jīng)兩種貽貝蛋白包被處理的光滑純鈦表面均形成了一層由貽貝蛋白顆粒密集排列構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)，其蛋白顆粒較為均一，粒徑約為300～600 nm(圖1b、圖1c)。

從X射線能量色散譜分析結(jié)果可看出，光滑鈦片表面主要為Ti、0元素分布(圖2a)。經(jīng)兩種蛋白包被后的鈦片表面可見N、C、O元素分布(圖2b、c)，說明鈦片表面有增加的蛋白成分，證實貽貝蛋白已覆蓋于純鈦表面。

2.2 真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)

成纖維細胞消化培養(yǎng)后4 h開始貼壁，且細胞變長呈梭形，大約24 h貼壁完成，3 d后細胞呈現(xiàn)明顯的成纖維細胞特點(圖3)。

2.3 人真皮成纖維細胞在3組鈦片樣本表面的增殖效果

培養(yǎng)1～5 d，成纖維細胞在3種鈦片表面的增殖情況類似，兩種貽貝蛋白包被組的成纖維細胞增殖效果雖略高于光滑鈦片組，但三者之間各時間點均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(圖4)。

2.4 人真皮成纖維細胞在3組鈦片樣本表面的粘附效果

2.4.1 DiI－AcLDL 染色熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡下觀察可見，在培養(yǎng)后15、30 min和1 h 各時間點，Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被鈦片表面粘附的細胞數(shù)目均明顯多于光滑鈦片表面，而2、4 h時間點時，三者間無明顯差異;在1、2、4 h各時間點，Usun－afix和BD CELL－TAKTM包被鈦表面的成纖維細胞形態(tài)、細胞伸展面積均好于光滑鈦片表面，特別是4 h時，Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被鈦表面可觀察到大量呈現(xiàn)纖維狀伸展的細胞，而光滑鈦片組細胞伸展效果較差(圖5)。

2.4.2 MTT 法檢測粘附效果

培養(yǎng)15、30 min 和1、2 h 各時間點，Usun－afix和BD CELL－TAKTM包被鈦表面OD值均明顯大于光滑鈦表面，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而4 h時三者間均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Usun－afix組與BD CELL－TAKTM組相比，各時間點的粘附效果相似，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖6)。

圖1 3種鈦片樣本表面微形貌(SEM×50 000)

圖2 3種鈦片樣本表面化學組成分析(EDS)

圖3 人真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)(倒置顯微鏡×100)

圖4 成纖維細胞在3種不同鈦片表面的增值效果比較

圖5 DiI染色熒光顯微鏡觀察各組細胞粘附效果

圖6 人真皮成纖維細胞在3種鈦片表面的粘附效果比較

3 討論

多巴胺是海洋貽貝粘附蛋白交聯(lián)過程中的關(guān)鍵成分，將貽貝蛋白溶液在預處理材料的表面進行簡單的浸涂即可形成強力附著于礦物質(zhì)、金屬及高分子等多種材料表面的復合層。這是因為多巴胺易被氧化為多巴醌，多巴醌與多巴胺之間能夠發(fā)生歧化反應(yīng)并形成自由基，從而交聯(lián)聚合，或者醌基與多巴胺分子的氨基發(fā)生Michael加成反應(yīng)而形成聚多巴胺［7－8］。本研究所用 Usun－afix和 BD CELL－TAKTM貽貝蛋白能將非貼壁細胞吸附在培養(yǎng)容器的表面，并加速細胞的粘附，且其本身并無細胞毒性［5，9］。

經(jīng)皮種植體失敗的主要原因是上皮下行和細菌感染。目前大多數(shù)的研究目的是防止細菌感染，而不是修復周圍的皮膚與種植體的結(jié)合。本研究提出的思路是希望能促進成纖維細胞在鈦片表面早期粘附，盡快形成穩(wěn)定的生物學封閉，以期盡量減弱種植體植入早期的上皮下行和細菌侵襲，進而提高經(jīng)皮種植體植入的成功率［10］。成纖維細胞在光滑鈦表面、Usun－afix和BD CELL－TAKTM兩種貽貝蛋白包被的鈦片表面的增殖和粘附結(jié)果顯示:貽貝蛋白包被的鈦片表面能促進人真皮成纖維細胞在其表面的粘附并促進了細胞骨架的伸展，且時間點越早，促粘附的效果越好，但長期(5 d)觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的促增殖效果。通過檢測活細胞的代謝活性能確定細胞的數(shù)量，細胞代謝活性的高低與其粘附在基底表面的細胞數(shù)呈線性相關(guān)關(guān)系。在細胞粘附實驗中，考慮到細胞膜上的糖蛋白與貽貝蛋白粘結(jié)位點結(jié)合，可以迅速穩(wěn)定地粘附到鈦表面，而血清會使這些結(jié)合位點封閉，不利于細胞的粘附，故采用不含血清的培養(yǎng)基。MTT檢測結(jié)果顯示:在培養(yǎng)15、30 min 和1、2 h 各時間點，Usun－afix和BD CELL－TAKTM兩種貽貝蛋白包被表面均明顯促進成纖維細胞的粘附，說明貽貝蛋白在成纖維細胞貼壁的早期可發(fā)揮顯著作用，從而促進了細胞在材料表面的粘附，為以后形成良好的軟組織生物封閉奠定了基礎(chǔ)，進而有望進一步提高種植體的成功率。在4 h時間點，MTT檢測和DiI染色熒光顯微鏡下觀察，細胞結(jié)合數(shù)量均無明顯的差異，推測原因是在此時間點細胞在3種材料表面大部分均已完成了貼壁過程，從而沒有呈現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學差異。細胞增殖實驗也印證了這一觀點，1、3、5 d成纖維細胞在3種材料表面的增殖無明顯差異。

經(jīng)皮種植體植入成功并獲得持久的穩(wěn)定性依賴于種植體經(jīng)皮部軟組織良好的生物學封閉［11］。本結(jié)果證實貽貝蛋白包被鈦片表面能夠明顯促進人真皮成纖維細胞早期粘附，從而促進手術(shù)部位周圍結(jié)締組織的生長，但能否應(yīng)用于臨床還有待進一步的研究。海洋貽貝粘附蛋白強度高，生物安全性好，能在水中發(fā)揮作用，而且這種天然蛋白質(zhì)不會帶來環(huán)境污染，具有很大的應(yīng)用價值［11－12］。但目前對貽貝足絲蛋白的研究還很少，而且貽貝蛋白提取物產(chǎn)量低、價格昂貴使其具有一定的局限性［13］。通過基因工程合成貽貝蛋白是一種可行的技術(shù)［14－15］，有望帶來巨大地經(jīng)濟和社會效益。

［1］Von Recum AF.Applications and failure modes of percutaneous devices:a review［J］.J Biomed Mater Res，1984，18(4):323 －336.

［2］Jansen JA，Paquay YG，van der Waerden JP.Tissue reaction to soft－tissue anchored percutaneous implants in rabbits［J］.J Biomed Mater Res，1994，28(9):1047－1054.

［3］Puckett SD，Lee PP，Ciombor DM，et al.Nanotextured titanium surfaces for enhancing skin growth on transcutaneous osseointegrated devices［J］.Acta Biomater，2010，6(6):2352 － 2362.

［4］劉加鵬，蔣臻，楊丙曄，等.海洋貽貝粘附蛋白類的結(jié)構(gòu)與功能［J］.中國生物化學與分子生物學報，2007，23(11):899－904.

［5］Cha HJ，Hwang DS，Lim S，et al.Development of bioadhesives from marine mussels［J］.Biotechnol J，2008，3(5):631 －638.

［6］Hwang DS，Gim Y，Kang DG.Recombinant mussel adhesive protein Mgfp－5 as cell adhesion biomaterial［J］.J Biotechnol，2007，127(4):727－735.

［7］Zhao H，Waite JH.Coating proteins:structure and cross－linking in fp－1 from the green shell mussel Perna canaliculus［J］.Biochemistry，2005，44(48):15915－15923.

［8］Carrington E，Moeser GM，Thompson SB，et al.Mussel attachment on rocky shores:the effect of flow on byssus production［J］.Integr Comp Biol，2008，48(6):801 －807.

［9］Aldred N，Ista LK，Callow ME，et al.Mussel(Mytilus edulis)byssus deposition in response to variations in surface wettability［J］.J R Soc Interface，2006，3(6):37 －43.

［10］Wei H，Wu S，F(xiàn)eng Z.Increased fibroblast functionality on CNN2－loaded titania nanotubes［J］.Int J Nanomedicine，2012，7:1091－1100.

［11］Lu Q，Hwang DS，Liu Y.Molecular interactions of mussel protective coating protein，mcfp－1，from Mytilus californianus［J］.Biomaterials，2012，33(6):1903 －1911.

［12］Hwang DS，Gim Y，Yoo HJ，et al.Practical recombinant hybrid mussel bioadhesive fp－151［J］.Biomater，2007，28(24):3560－3568.

［13］Shao H，Bachus KN，Stewart RJ，et al.A water－borne adhesive modeled after the sandcastle glue of P californica［J］.Macromol Biosci，2009，9(5):464 －471.

［14］Yu J，Wei W，Danner E，et al.Effects of interfacial redox in mussel adhesive protein films on mica［J］.Adv Mater，2011，23(20):2362－2366.

［15］Hwang DS，Kim KR，Lim S，et al.Recombinant mussel adhesive protein as a gene delivery material［J］.Biotechnol Bioeng，2009，102(2):616－623.