楊 昊，魯 紅，陳發(fā)明，金 巖

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安710032)

牙周病治療中牙周缺損的修復(fù)是國際關(guān)注的難題。傳統(tǒng)的牙周治療方法雖然能有效控制牙周病的發(fā)展進程，但卻不能使缺失的牙周支持組織再生。自2004年美國施松濤教授發(fā)現(xiàn)人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以來，使干細胞治療為牙周組織再生帶來了新的希望，有望成為未來牙周病治療的重要手段［1］。而引導(dǎo)組織再生術(shù)(guide tissue regeneration，GTR)作為牙周病治療的主要方法［2］，是在牙周手術(shù)中利用膜性材料作為屏障，阻擋牙齦上皮在愈合過程中沿根面生長，引導(dǎo)具有形成新附著能力的牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)優(yōu)先占領(lǐng)根面，形成新的附著性愈合。由此可見:生物膜材料的阻擋作用和生物相容性對GTR具有重要影響［3］。Bio－Gide生物膜是瑞士Geistlich Pharma AG集團有限公司的產(chǎn)品，已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其為組織再生提供空間的機械屏障作用已被充分認可［4－6］，但作為細胞載體材料，特別是與PDLSCs的結(jié)合及其附著能力的研究尚少，而細胞載體的研究在牙周組織工程研究中具有重要的地位和作用［7］?？紤]到該材料具有長期臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，如果能夠?qū)⑵渥鳛榧毎d體，應(yīng)用于牙周組織工程和細胞治療中，將加速臨床轉(zhuǎn)化的進程。為進一步開發(fā)Bio－Gide在牙周再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，本研究通過觀察人PDLSCs在Bio－Gide生物膜材料上的粘附生長情況，為其作為有效的細胞載體用于牙周組織工程治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

Bio－Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士);α－MEM 培養(yǎng)基、L－谷氨酰胺、青、鏈霉素、(Gibco公司，美國);胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程有限公司);2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國);Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國);地塞米松、β－甘油磷酸鈉、異丁基甲基黃嘌呤IBMX、抗壞血酸(Sigma，美國);抗 CD31、抗 CD34、抗 CD45、抗 CD90、抗CD105、抗 CD29、抗 CD146、抗 STRO－1 抗體(R＆D Systems，美國);茜素紅、油紅O、二甲基亞砜DMSO(Sigma公司，美國)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國);離心機 (Kubota2l00，日本);YJ－875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(OlympusIX70，日本);體視顯微鏡(Olympus，日本);掃描電鏡(日立 S－4800，日本);6孔培養(yǎng)板、24孔板、平底96孔板(Falcon，美國);10 cm直徑細胞培養(yǎng)皿(Corning，Lowell，美國);流式細胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，美國);超聲震蕩儀(上海生源器械廠);酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO－TEK，美國);紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國)。

1.2 人牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 牙周膜干細胞的原代培養(yǎng)

選取5名年齡16～45歲健康(否認全身性疾病)志愿者(知情同意)拔除無牙周病的第三磨牙(上頜4個，下頜5個)，立即在超凈工作臺內(nèi)刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm并移入離心管內(nèi)，以 I型膠原酶在37℃下消化15 min后接種于6孔板中，置蓋玻片并滴加含100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基，置 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)10～15 d，每2天換液1次。待細胞從組織塊邊緣爬出并達到80%匯合時，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 牙周膜干細胞的分離、純化

有限稀釋法克隆分離PDLSCs:取上述細胞用α－MEM制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為10/mL以下，接種于 96孔板，每孔 0.1 mL，在 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后顯微鏡下觀察并標記含單個細胞孔，補加0.1 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天換液。當(dāng)細胞形成克隆(集落細胞數(shù)≥50)并長至孔底1/2時，胰蛋白酶消化，擴大培養(yǎng)，即為PDLSCs。

1.2.3 PDLSCs的鑒定

1.2.3.1 細胞克隆形成能力的檢測

取克隆純化的第4代細胞用胰酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，以1×103個細胞接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻后置37℃的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。14 d后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS浸洗2遍，甲苯胺藍染色20 min，PBS洗2遍，顯微鏡下觀察并拍照。以多于50個細胞的集落計為一個克隆，并計算克隆形成率。

1.2.3.2 細胞生長曲線測定

取克隆純化的第4代細胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104/mL后接種于 96 孔板，每孔 200 μL，置37℃，50 mL/L CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。24 h后每孔加5 mg/mL的MTT液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加160 μL DMSO振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔490 nm處的吸光值(OD值)。并以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3.3 干細胞表面標志物檢測

取克隆純化的第4代細胞胰酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106/mL后用含30 mL/L FBS的PBS洗2遍，裝入EP管中，分別加入適當(dāng)量的 CD90、CD105、CD29、STRO－1、CD146、CD31、CD34、CD45 抗體于4℃冰箱中孵育。1 h后用含3 mL/L FBS的PBS洗去抗體，用流式細胞儀在避光條件下進行抗體檢測。其中STRO－1是Alexa Fluor647標記;CD45、CD146、CD90、CD31 為 PE 標記;CD105、CD29、CD34為FITC標記。

1.3 Bio－Gide生物膜的細胞毒性實驗

1.3.1 Bio－Gide 生物膜浸提液的制備

參照GB/T 16886.5醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分細胞毒性試驗體外法，將Bio－Gide生物膜用Co60射線消毒后切成5 mm×25 mm，按3 cm2/mL的比例加入含100 mL/L的FBS的 α－MEM培養(yǎng)液，于37℃下浸提24 h，取浸提液用于以下實驗。

1.3.2 MTT 法測細胞毒性

取克隆純化的第4代細胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成細胞懸液，調(diào)細胞密度為1×104/mL接種于 96孔板，每孔 200 μL，置 37℃、50 mL/L CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄原液，將細胞隨機分為2組，每組8孔，其中對照組加入200 μL的 α－MEM 培養(yǎng)液，實驗組加入200 μL的Bio－Gide生物膜浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天時，于各組各孔加入20 μL MTT液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加160 μL的DMSO，低速震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔490 nm波長處的吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。以下列公式計算各組細胞的相對增殖率(RGR)。

并根據(jù)國家標準將RGR值轉(zhuǎn)換成6級反應(yīng)(表1)，以評定材料的毒性程度:0、1級為合格;2級應(yīng)結(jié)合細胞形態(tài)分析，綜合評價;3～5級為不合格。

表1 RGR值轉(zhuǎn)換6級反應(yīng)標準

1.4 PDLSCs在 Bio－Gide生物膜上生長、粘附情況觀察

1.4.1 掃描電鏡觀察生長情況

將 Bio－Gide生物膜剪成1.5×1.5 cm 后置24孔板中。取生長狀態(tài)良好的第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化并用α－MEM制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液后接種于生物膜片上常規(guī)培養(yǎng)，在培養(yǎng)后8 h、1、3、7、12 d 時中止培養(yǎng)，取生物膜片用固定液固定后，電鏡樣本制備常規(guī)掃描并觀察拍照。

1.4.2 熒光顯微鏡觀察細胞的粘附情況

將生物膜剪成1.5×1.5 cm后置24孔板中，同時設(shè)不放生物膜的孔作為對照，取生長狀態(tài)良好的第3代PDLSCs用含100 mL/L FBS的α－MEM制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液后接種于上述24孔板中，每孔1 mL，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后于各組各孔滴加Hochest熒光核染色劑，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，吸取上清液，熒光顯微鏡下觀察并進行細胞核計數(shù)(實驗重復(fù)8次)，以下列公式計算細胞粘附率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用獨立樣本均數(shù)t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

本研究參照課題組前期報道［8］，采用酶消化組織塊法培養(yǎng)人PDLCs，一般10 d左右可見細胞從組織塊邊緣爬出，大約3周左右原代細胞達80%匯合。可見細胞呈長梭形，有細胞突觸，胞核聚集在中心，具有成體干細胞的特征(圖1)。培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞在7 d左右出現(xiàn)克隆集落，呈旋渦狀生長，集落內(nèi)細胞密度隨時間逐漸增加，細胞形態(tài)為長梭形，細胞突起明顯(圖2)。14 d時計算克隆形成率為(12.9±0.6)%。細胞生長曲線基本成S形，第2天與第1天比較無明顯增殖，第3天開始基本成對數(shù)增長，第7天時細胞增殖進入平臺期(圖3)。通過對細胞表面抗原的檢測，對造血系標志物CD34、CD45和內(nèi)皮系標志物CD31表達陰性;而高表達一系列干細胞表面標志物STRO－1、CD146、CD105、CD29、CD90(圖 4)。其中 STRO－1是 11.9%，CD146是 45.5%，CD105是 92.1%，CD29是99.5%，CD90是 100%，CD34是 0.7%，CD45 是1.9%，CD31 是0.2%。

圖1 牙周膜細胞原代培養(yǎng)10 d(×40)

圖2 14 d時單細胞克隆(×15)

圖3 MTT法檢測細胞生長曲線

圖4 流式細胞儀檢測細胞表面標記物

2.2 細胞毒性實驗

實驗組吸光度均值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，其增殖率 RGR=122.66%(表2)。根據(jù)表1評定標準其毒性級為0級，無毒性。

表2 細胞毒性實驗結(jié)果 (n=8)

2.3 掃描電鏡觀察PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的生長情況

Bio－Gide生物膜的基本組成成分Ⅰ型和Ⅲ型膠原，電鏡下可見粗大的膠原纖維束(圖5a)。通過對生物膜上不同時段細胞的觀察，可看到細胞在生物膜上有很好的貼附生長，8 h觀察細胞在生物膜上已經(jīng)附著并伸展呈長梭形及多角形，部分細胞成短梭形(圖5b)。而24 h細胞已經(jīng)完成貼壁，視野中均為長梭形細胞，高倍鏡下可見細胞附著較密集，細胞與細胞間有空隙，可見下層的膠原束(圖5c)。3 d時細胞增殖較多，匯合成片狀，基本覆蓋細胞下方的膠原束(圖5d)，但在低倍鏡下仍可見不同的膠原層次(圖5e)。7 d時細胞已經(jīng)完全成膜狀生長，低倍鏡下觀察，生物膜表面呈平滑狀，膠原束已經(jīng)完全被細胞膜遮擋，膜表面可見細胞生長的片狀紋理，少數(shù)細胞膜片之間未完全融合留有裂隙(圖5f)。12 d時在低倍鏡下觀察細胞生長密集，形成的膜片較7 d時增厚，細胞膜片之間的裂隙也明顯減少(圖5g)。

2.4 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況

將與生物膜共同培養(yǎng)的PDLSCs上清液用Hochest熒光核染色劑染色后，熒光顯微鏡下進行細胞計數(shù)，結(jié)果顯示:實驗組上清液中細胞數(shù)為(13.3±3.4)×104，其細胞粘附率為(86.7 ±3.4)%，明顯高于對照組(P ＜0.05)(表3)。

圖5 PDLSCs在生物膜上培養(yǎng)不同時間點掃描電鏡觀察

表3 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況(n=8)

3 討論

牙周治療的最終目標，是實現(xiàn)牙周支持組織的功能性再生，傳統(tǒng)的治療方法雖能有效控制牙周病的發(fā)展過程，但卻不能達到牙周組織再生的目的。GTR技術(shù)的應(yīng)用大大提高了牙周治療的臨床效果，但其與真正的牙周支持組織的生理性和功能性再生還有一定的距離。

近年來，組織工程的發(fā)展為牙周缺損的治療帶來了新的思路，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度、功能相關(guān)的活細胞種植于具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質(zhì)材料上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，將這種細胞與生物材料復(fù)合體植入機體病損部位，以形成新的具有原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。而牙周膜干細胞的發(fā)現(xiàn)又為牙周組織工程的構(gòu)建提供了理想的細胞來源。大量的動物實驗表明:利用牙周膜干細胞進行牙周組織的細胞治療，均能實現(xiàn)較為理想的牙周缺損組織的生理性和功能性再生［9－11］。而在利用組織工程技術(shù)進行牙周治療的過程中，細胞載體的運用起著重要的鏈接作用，但目前還沒有一種可供臨床應(yīng)用的良好細胞載體，因此大大延緩了牙周組織工程(特別是細胞治療)基礎(chǔ)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化進程。

在GTR和骨再生手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用的Bio－Gide生物膜是瑞士蓋氏骨替代品產(chǎn)品，該生物膜主要由致密層和疏松層組成。致密層主要是阻止軟組織長入植骨區(qū)域，疏松層主要是容納血細胞和成骨細胞，使骨膜能與植骨區(qū)更易貼合，更易新骨的形成。該材料良好的機械屏障作用已經(jīng)得到認可，但目前還未見該材料作為細胞載體用于牙周組織再生的有關(guān)報道。因此，如能將GTR中的屏障膜作為細胞載體，特別是與PDLSCs結(jié)合用于牙周組織工程和細胞治療中，定將加速臨床轉(zhuǎn)化的過程。本研究通過觀察PDLSCs在Bio－Gide膜材料上的生長、粘附情況，證明該生物膜具有良好的生物相容性，無細胞毒性，能夠支持PDLSCs成膜性生長，有望成為良好的牙周組織工程細胞載體材料。

［1］Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364(9429):149 －155.

［2］Bosshardt DD，Sculean A.Does periodontal tissue regeneration really work?［J］.Periodontol，2000，2009，51(1):208 －219.

［3］Bottino MC，Thomas V，Schmidt G，et al.Recent advances in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration－a materials perspective［J］.Dent Mater，2012，28(7):703－721.

［4］Tonetti MS，Cortellini P，Lang NP，et al.Clinical outcomes following treatment of human intrabony defects with GTR/bone replacement material or access flap alone.A multicenter randomized controlled clinical trial［J］.J Clin Periodonto，2004，31(9):770－776.

［5］Schwarz F，Bieling K，Latz T，et al.Healing of intrabony periimplantitis defects following application of a nanocrystalline hydroxyapatite(Ostim)or a bovine－derived xenograft(Bio－Oss)in combination with a collagen membrane(Bio－Gide).A case series［J］.J Clin Periodontol，2006，33(7):491 －499.

［6］Sculean A，Schwarz F，Chiantella GC，et al.Five－year results of a prospective，randomized，controlled study evaluating treatment of intra－bony defects with a natural bone mineral and GTR［J］.J Clin Periodontol，2007，34(1):72 －77.

［7］Chen FM，Sun HH，Lu H，et al.Stem cell－delivery therapeutics for periodontal tissue regeneration［J］.Biomaterials，2012，33，in press.

［8］張璟，楊昊，高麗娜，等.年齡因素對人牙周膜干細胞培養(yǎng)和性能的影響［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22(3):136－140.

［9］Akizuki T，Oda S，Komaki M，et al.Application of periodontal ligament cell sheet for periodontal regeneration:a pilot study in beagle dogs［J］.J Periodontal Res，2005，40(3):245 －251.

［10］Liu Y，Zheng Y，Ding G，et al.Periodontal ligament stem cellmediated treatment for periodontitis in miniature swine［J］.Stem Cells，2008，26(4):1065 －1073.

［11］Ding G，Liu Y，Wang W，et al.Allogeneic periodontal ligament stem cell therapy for periodontitis in swine ［J］.Stem Cells，2010，28(10):1829－1838.