高文彬，張雅梅，宋學(xué)洲，田 野，程 鴻，包海鷹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院菌物研究所，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

檸檬黃蠟傘 （Hygrophorus lucorum Kalchbr）[1]，別名檸檬蠟傘[2]，俗稱黃油蘑[3]、小黃蘑，屬真菌門（Eumycota）、擔(dān) 子 菌 亞 門 （Basidiomycotina）、層 菌 綱 （Hymenomycetes）、傘菌目 （Agaricales）、蠟傘科 （Hygrophoraeae）。檸檬黃蠟傘群生或散生于針葉林或針闊混交林地上，在吉林省長白山地區(qū)[4]、燕山地區(qū)[5]和內(nèi)蒙古阿爾山地區(qū)[6]廣為分布。該菌味道好，干品色澤金黃，民間多用干品燉雞來滋補(bǔ)身體。檸檬黃蠟傘化學(xué)成分國內(nèi)外均未見報(bào)道，生理活性也只有抗氧化活性的報(bào)道[5]。對(duì)檸檬黃蠟傘子實(shí)體提取物的抑菌活性以及石油醚層化學(xué)成分進(jìn)行研究，證明其可以代謝產(chǎn)生具有抗菌作用的活性成分，為下一步的活性化合物研究以及合理開發(fā)利用這一天然菌物資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材

檸檬黃蠟傘子實(shí)體（干品） 購自阿爾山地區(qū)（2010年產(chǎn)）；經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，菌物研究所圖力古爾老師鑒定為檸檬黃蠟傘（Hygrophorus lucorum Kalchbr）。

1.1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（Salmonella enterica）、鏈球菌 （Streptococcus）、大腸桿菌(Escherichia coli)，以上菌種由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis）、玉米紋枯病菌（Rhizopus spp.）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosparioides）、甘薯黑斑病菌 （Ceratocystis fimbriata）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、禾鐮刀菌（Fusarium graminearum）由吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.3 供試陽性藥

阿米卡星注射液，批號(hào)110905，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；硫酸慶大霉素注射液，批號(hào)110902，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；氯霉素注射液，批號(hào)1106092，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司；頭孢曲松鈉注射液，批號(hào)110432076，蘇州東瑞制藥有限公司；硝酸咪康唑乳膏，批號(hào)110404j，深圳三九藥業(yè)。以上藥品均購自長春市吉林大藥房。

1.1.4 試劑

環(huán)己烷，分析純，汕頭市西隴化工有限公司；石油醚（30℃~60℃）、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇，分析純，天津化學(xué)試劑有限公司。

1.1.5 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%，pH為7.4）；LBA培養(yǎng)基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.8%，pH為7.4）；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%）。

1.1.6 菌株培養(yǎng)

細(xì)菌無菌條件下，以移液槍吸取0.01 mL菌種于LB培養(yǎng)基內(nèi)，密封并輕輕搖勻，置37℃搖床（轉(zhuǎn)速200r·min-1）中培養(yǎng)10 h~18 h。真菌無菌條件下，將菌種接在PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，封口，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h~96 h。

1.1.7 設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀為Agilent6890N型GC和Agilent5973IMSD型MS并配有NIST5圖譜系統(tǒng)；Finnigan-MAT.LCQ型的電噴霧質(zhì)譜儀；BrukerAM-400LBz型核磁共振波譜儀；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，HH·CP-01W；凍干機(jī)，F(xiàn)DU-1200。

1.2 檸檬黃蠟傘提取物的制備

將檸檬黃蠟傘實(shí)體3 000 g，25℃烘干，粉碎，甲醇室溫提取3次，每次12 h，每小時(shí)攪拌1次，合并提取液，減壓濃縮得到提取物，加水懸浮，分別用石油醚（60℃~90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，萃取液減壓濃縮得到各部分萃取物，低溫保存。

1.3 受試樣品的制備

取各提取物，凍干機(jī)冷凍干燥，密封，低溫保存。用前倍半法稀釋：50 mg·mL-1、25 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.025 mg·mL-1、1.5125 mg·mL-1；空白組：相應(yīng)的溶劑。

1.4 供試陽性藥的制備

硫酸阿米卡星注射液（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取硫酸阿米卡星注射液1.0 mL于100 mL無菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。慶大霉素（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取硫酸慶大霉素注射液1.0 mL于200 mL無菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。氯霉素（1.00 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取氯霉素注射液0.8 mL于100 mL無菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。頭孢曲松鈉（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確稱取注射用頭孢曲松鈉0.1 g于100 mL無菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。

1.5 抑菌試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法測定[7]，無菌條件下，取直徑為7.0 mm的圓形濾紙片蘸取供試溶液（完全浸透且無液滴滴落），在超凈工作臺(tái)中吹干后將該濾紙片均勻擺放在涂有細(xì)菌菌懸液的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻擺放6個(gè)紙片，分別為供試藥、陽性藥和陰性對(duì)照，重復(fù)3次。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h~18 h后，采用十字交叉法測量抑菌直徑。真菌是在無菌條件下用7.0 mm打孔器將長滿菌絲體的培養(yǎng)皿打孔，將菌餅接到PDA培養(yǎng)基上每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻擺放4個(gè)紙片是供試藥，重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h~72 h后，采用十字交叉法測量抑菌直徑。

1.6 最低抑菌濃度（MIC） 測定

采用試管二倍稀釋法測定[8]，使用LB液體培養(yǎng)基（2 mL·管-1）將藥物對(duì)倍稀釋成系列濃度，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)管，然后加入0.1 mL菌液。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以混濁度為指標(biāo)檢查該管中有無細(xì)菌生長，眼觀選出不顯示混濁試管，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)37℃，24 h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上無細(xì)菌生長而含藥液濃度最低者，即為該種藥物對(duì)該菌株的最低抑菌濃度。

1.7 結(jié)果計(jì)算

以抑菌圈直徑（mm）、抑菌率（%） 來評(píng)定藥物的抑菌作用。抑菌率（P）的計(jì)算公式如下[8]：

式中：R1表示供試樣品抑菌圈直徑；R2表示濾紙片直徑；R3表示陽性藥抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性藥的篩選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，陽性藥的抑菌圈直徑不宜過大，否則抑菌圈會(huì)覆蓋至相鄰紙片上，或者2個(gè)相鄰抑菌圈相連，從而影響測量準(zhǔn)確度；陽性藥抑菌圈直徑過小，則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)時(shí)的準(zhǔn)確度，使誤差變大。結(jié)果見表1。

表1 不同陽性藥的抑菌圈直徑

結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌、大腸桿菌的最佳陽性藥為阿米卡星（1.00 mg·mL-1）。

2.2 檸檬黃蠟傘子實(shí)體提取物的抑菌作用

檸檬黃蠟傘子實(shí)體提取物的抑菌結(jié)果見表2。

檸檬黃蠟傘石油醚相、乙酸乙酯相對(duì)所選9種真菌均無明顯抑制作用，對(duì)4種細(xì)菌沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較好的抑制作用，正丁醇層和水層均無效果，乙酸乙酯層提取物的抑制作用最好，在濃度是50 mg·mL-1時(shí)抑菌率最高，分別是55.08%、42.97%、61.10%和50.08%（表2）。石油醚層提取物對(duì)4種菌的MIC 值分別為 3.125 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.125 mg·mL-1和3.125 mg·mL-1。乙酸乙酯層提取物對(duì)4種菌的MIC值均為 3.125 mg·mL-1。

表2 檸檬黃蠟傘子實(shí)體提取物對(duì)的抑菌效應(yīng)

2.3 檸檬黃蠟傘石油醚層化學(xué)成分

石油醚層的GC-MS分析，其GC-MS總離子流色譜圖如圖1所示。采用WIKEY.L圖譜檢索，并結(jié)合質(zhì)譜圖中基峰、負(fù)荷比以及相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比較，在石油醚層中鑒定出個(gè)5化合物，結(jié)果見表3。

圖1 檸檬黃蠟傘揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

3 討論

近年來，從真菌中發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)新穎且具有生理活性的物質(zhì)，根據(jù)真菌的生理特性，不僅可以直接利用子實(shí)體，而且還可以利用菌絲體或孢子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)大量繁殖。這對(duì)于現(xiàn)代藥物、食品防腐以及農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。我國真菌資源豐富，許多學(xué)者對(duì)這一資源進(jìn)行考察發(fā)掘，一些新的有藥用價(jià)值的真菌已被進(jìn)行深入地研究并投入生產(chǎn)，但是從總體上來說該學(xué)科發(fā)展還是較慢，直至2010年版藥典收載的有藥用的真菌類只有7種[9]。因此，以真菌為原料，進(jìn)行活性篩選，對(duì)活性成分跟蹤分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，利用液體發(fā)酵技術(shù)定向大量生產(chǎn)活性成分，對(duì)新藥的開發(fā)和利用具有十分重要的意義。本文對(duì)檸檬黃蠟傘不同提取部位的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，檸檬黃蠟傘子實(shí)體的提取物對(duì)所選的9種真菌均無明顯抑制作用，Gianluca Gilardoni從同科的金粒蠟傘（Hygrophorus chrysodon）新鮮子實(shí)體中分離得到 2個(gè) 2-?；h(huán)戊烯-1，3-二酮衍生物，chrysotrione A和B，對(duì)植物病原菌輪枝樣鐮孢菌（Fusarium verticillioides）具有抑制作用[10]，本實(shí)驗(yàn)檸檬黃蠟傘子實(shí)體粗提物對(duì)所選的植物病原菌并沒有明顯的抑制作用，可能是在粗提物中抑菌活性物質(zhì)含量太低，并未表現(xiàn)抑菌活性，下一步將擴(kuò)大篩選范圍，尋找特異的靶標(biāo)真菌。石油醚層和乙酸乙酯層對(duì)所選細(xì)菌均有有較好的抑制作用，下一步對(duì)其抑菌活性成分進(jìn)行跟蹤分離和結(jié)構(gòu)研究，同時(shí)對(duì)其液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步的基于活性物質(zhì)為基礎(chǔ)的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。Bertrand Veau從青黃蠟傘（Hygrophorus hypothejus） 分離出 lectin（HHL） 具有凝血的作用[11]。Norman Mier報(bào)道金粒蠟傘 （Hygrophorus chrysodon） 和金黃擬蠟傘 （Hygrophoropsis aurantiaca） 對(duì)果蠅幼蟲有毒殺作用[12]。Antonella Del Signore分析了淺黃褐色蠟傘 （Hygrophorus leucophaeus） 中的總酚含量為4.15%[13]，熊偉從淡紅蠟傘菌（Hygrophorus russula Fr.）提取出多糖，多糖得率為6.52%[14]，多酚和多糖具有多種生理活性，本課題組將對(duì)檸檬黃蠟傘的化學(xué)成分就行全面的分析，探究其是否具有其他的生理活性，為更好的利用這一真菌資源提供理論依據(jù)。

表3 檸檬黃蠟傘子實(shí)體石油醚成分的氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析結(jié)果

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