馮一建，陳 勇，張增濤，黃 程，李紅亮，胡春蘭，范 開，

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

人角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)是具有肝素結合特性的成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)家族中的一員，分為 KGF－I(FGF－7)和 KGF－II(FGF－10)2 種亞型［1］。成熟的 KGF－I由 163個氨基酸組成，包括位于1、15、40、102和106位的5個半胱氨酸殘基。天然的KGF－I不穩(wěn)定，在溫和的溫度下也容易聚合。已經證實KGF－I的N端23個氨基酸殘基缺失后的截短形重組人 KGF－I(以下稱△N23KGFI)的穩(wěn)定性得到提高，同時體內外生物學作用保持不變［2－3］。

在國外，經大腸桿菌表達的△N23KGF－I(商品名Kepivance)在臨床上用于腫瘤放療、化療后的口腔粘膜損傷或粘膜炎的治療和保護?！鱊23KGF－I的半衰期較短，約為4.5 h，需要在放療或化療前后連續(xù)給藥6 d，用藥量為60 μg/(kg·d)。為了實現延長其體內半衰期，進一步降低免疫原性以及達到改6次連續(xù)給藥1次的目的，可以對△N23KGF－I進行聚乙二醇修飾。

△N23KGF－I的N末端是KGF發(fā)揮生物學作用的重要區(qū)域，對△N23KGF－I的N末端進行PEG修飾后其體外生物活性降低明顯，所以不能對△N23KGF－I進行 N 末端修飾［4］。而△N23KGF－I含有17個賴氨酸殘基，對其定點修飾不能保證其修飾的均一性，純化難度極大，因此也排除?！鱊23KGF－I只含有3個半胱氨酸殘基(Cys40，102，106)，其中 Cys102－106 已經形成一對二硫鍵，只有Cys40一個半胱氨酸殘基處于游離狀態(tài)，因此，可以選用常用的 mPEG－馬來酰亞胺(mPEG－maleimide、mPEG－Mal)對 Cys40進行修飾。本文的主要目的是對△N23KGF－I的mPEG－Mal修飾工藝進行研究，初步確認修飾位點和體外活性。

1 儀器與材料

2487型高效液相色譜系統(tǒng)與紫外檢測器(Waters);ESI－Q－TOF micro 型質譜儀及Masslynx4.0液質聯用分析軟件(Waters);AKTA Purifier純化系統(tǒng)(GE Health);色譜柱 SG300? C8(4.6 mm ×150 mm，5μm);ultimate?XB－C18(4.6 mm ×250 mm，5μm);半胱氨酸(分析純);胱氨酸(分析純);mPEG－Mal－20K(北京鍵凱科技有限公司生產);Trypsin singles(Sigma，貨號 T7575);乙腈(Sigma，色譜純);實驗用水為 Milli－Q 超純水。

BAF－3細胞株，齊魯制藥生產。

2 方法

2.1 △N23KGF－I的重組制備

大腸桿菌菌體經IPTG誘導表達△N23KGF－I。在檸檬酸三納/Tris的緩沖體系中，用常規(guī)的化學破菌法破菌，再用SP Sepharose F.F.純化，然后在△N23KGF－I樣品中補加半胱氨酸－胱氨酸，摩爾濃度分別為10 mmol/L和1mmol/L，在pH值為8.0，30℃下反應0.5 h，之后在含1 mmol/L的Tris透析液中透析復性過夜。用Heparin Sepharose 6 F.F.含鹽洗脫復性樣品，再通過 SDS－PAGE和 RPHPLC對樣品進行純度分析和定量分析。

2.2 △N23KGF－I質量肽圖分析

［5－6］的方法對△N23KGF－I做還原和非還原質量肽圖。

2.3 △N23KGF－I的Cys40聚乙二醇修飾

參考文獻［7］，改變其修飾 pH值 (6.5、7.0、7.5)，蛋白與 mPEG－Mal－20K 的摩爾比為 1 比 4，反應時間為3 h，對蛋白進行飽和修飾。

研究發(fā)現，mPEG－Mal－20K不能修飾到△N23KGF－I上，因此，考慮在變性劑尿素的環(huán)境下修飾目的蛋白。在尿素濃度為1、2、3、4 mol/L，蛋白與 mPEG－Mal－20K 的摩爾比為 1 比 4，pH 值為6.5的條件下修飾3 h。再通過 SDS－PAGE和RP－HPLC對樣品進行純度分析和定量分析。

2.4 △N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 的純化

△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 樣品稀釋 5 倍，經 SP Sepharose F.F.純化，方法同本文2.1 節(jié)。

2.5 △N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 質量肽圖分析

參考文獻［5－6］的方法對△N23KGF－I－mPEGMal－20K做還原質量肽圖。

2.6 △N23KGF－I 及△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K體外活性測定

2.6.1 供試品溶液的制備

樣品(△N23KGF－I國際標準品、△N23KGF－I、△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K)用無菌超純水稀釋，當稀釋至4 μg/mL時用0.25%FBS+培養(yǎng)液稀釋20倍，得200 ng/mL，以此為起始濃度，做4倍系列稀釋，共10個稀釋度，每個濃度做2個孔。

2.6.2 活性測定

BAF－3細胞株(轉染了 KGF－2受體)用常規(guī)方法培養(yǎng)，使1 mL溶液含2.0×105～4.0×105個細胞。離心收集細胞，用0.25%FBS+培養(yǎng)液洗細胞3次，用0.25%FBS+培養(yǎng)液配成每1 mL含2.0×105～4.0 ×105個細胞的細胞懸液，37℃?zhèn)溆?。?6孔細胞培養(yǎng)板中加入供試品溶液50μL/孔，并設立陰性孔2孔，再加入細胞懸液50 μL/孔。置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)48 h。每孔加入MTS 溶液20 μL，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)0.5 h。混勻后在酶標儀上，波長490 nm處測定吸光度，記錄并分析處理結果。

3 實驗結果與討論

3.1 △N23KGF－I的重組制備

通過洗脫條件的優(yōu)化，得到高純度樣品(圖1、2)，純度達到98%。

3.2 △N23KGF－I質量肽圖分析

參考文獻［5］，由圖 3、4可以得出結論:△N23KGF－I的Cys102和Cys106形成了二硫鍵。

圖3 △N23KGF－I還原質量肽圖

3.3 △N23KGF－I的Cys40聚乙二醇修飾

實驗發(fā)現，在沒有變性劑的情況下，mPEGMal－20K不能修飾到△N23KGF－I上。在 pH 值為6.5，尿素終濃度為2 mol/L時，修飾率只有50%;當尿素濃度達到3 mol/L時，修飾率達到85%左右;當尿素濃度達到4 mol/L時，修飾率達到95%(圖 5 ～ 6)?！鱊23KGF－I－mPEG－Mal－20K 的 RPHPLC出峰時間和△N23KGF－I的出峰時間相同，不能用其進行RP－HPLC分析。

3.4 △N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 的純化

當修飾后的樣品 經過SP Sepharose F.F.后，能夠得到純度達到95%的修飾蛋白。

3.5 △N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 質量肽圖分析

由圖7可見只有位置C的肽段消失，而這正是圖8中黑框的肽段，即含有Cys40的肽段，證明mPEG－Mal－20K 修飾到了△N23KGF－I的 Cys40。

3.6 △N23KGF－I 及△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K體外活性測定

△N23KGF－I有促進表皮細胞增生的生物學活性的作用。蛋白活性越高，細胞生長越好，顯色越深。通過對實驗結果的分析和處理(見表1)可以看出，本實驗純化的蛋白活性良好。

表1 蛋白活性

4 結束語

通過對△N23KGF－I做還原、非還原質量肽圖以及對△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K 做還原質量肽圖，可以確定在帶有3 mol/L尿素，pH值為6.5時，mPEG－Mal－20K 確實均一修飾到了△N23KGF－I的Cys40上，而不是修飾在Cys102或Cys106上。在沒有尿素的情況下，蛋白不能被修飾，可能是Cys40處于△N23KGF－I空間結構的內部，缺少與PEG的接觸機會的緣故。在體外活性初步測定中，對比△N23KGF－I國際活性標準品，△N23KGFI 的 活 性 保留了 116%，△N23KGF－I－mPEG－Mal－20K的活性保留了36%，說明本實驗純化得到的蛋白活性已達到標準品的水平。標準品的活性相對低，這可能是標準品存放的時間相對較長，活性有所下降?！鱊23KGF－I－mPEG－Mal－20K 的活性偏低，則可能是因為大分子PEG占據了很大的空間，影響了蛋白與受體的結合，影響了蛋白的生物活性發(fā)揮。但是如果其生物學作用能夠維持到3 d以上(效果等同于3 d連續(xù)給藥△N23KGF－I)，雖然單次給藥量增加了，但給藥次數減少了，病人的痛苦減小了，這還是有優(yōu)勢的。3 mol/L尿素的已經改變了△N23KGF－I原本的空間構象，修飾后的空間結構也可能發(fā)生了改變，因此很可能產生新的生物學活性，這需要實驗來證明。

在常規(guī)條件下，若蛋白不能被PEG或其他大分子修飾，可以考慮在其中補加適量的變性劑后再進行修飾。

參考文獻:

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［3］Eric H，Timothy O.Enhanced Stability of recombinant keratinocyte growth factor by mutagenesis Protein Engineering［J］.Design ＆ Selection，2006，19(4):147－153.

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［5］張增濤，陳清，羅嵐，等.重組人角質細胞生長因子I型缺失突變體二硫鍵配對與生物活性［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2010，24(5):44－53.

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［7］Antoni Kozlowski.Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates［P］.USA patent:US 7329721B2.2008－02－12.