王明波，王 俊，譚榮偉，佘振定

(1.深圳清華大學(xué)研究院生物醫(yī)用材料及植入器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518057；2.深圳蘭度生物材料有限公司，廣東深圳 518057)

離心—冷凍法制備梯度孔結(jié)構(gòu)的真皮支架

王明波1，王 俊1，譚榮偉2，佘振定1

(1.深圳清華大學(xué)研究院生物醫(yī)用材料及植入器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518057；2.深圳蘭度生物材料有限公司，廣東深圳 518057)

膠原基真皮支架的結(jié)構(gòu)和性能受多方面因素影響，比如除膠原外的其他主要材料、支架的孔徑和孔隙率以及交聯(lián)度等.采用離心—冷凍法結(jié)合冷凍干燥法制備梯度孔結(jié)構(gòu)的真皮支架，表征支架的孔徑和孔隙率，并以細(xì)胞培養(yǎng)檢驗(yàn)其生物相容性，其中采用掃描電鏡對(duì)上中下3部分支架結(jié)構(gòu)及孔徑進(jìn)行表征，并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該支架材料的細(xì)胞粘附性能，以達(dá)到表征離心力的影響.結(jié)果顯示，離心力對(duì)支架的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，支架的致密程度從下到上有明顯的不同，具體表現(xiàn)在孔徑上:上層孔徑52±27.8μ m，中層孔徑57±8.7μ m，下層孔徑49±40.4μ m.同時(shí)，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明，致密的下層更適合細(xì)胞的粘附生長(zhǎng).

真皮支架；離心力；生物相容性

0 引 言

皮膚缺損是一類常見(jiàn)但未得到根本性解決的古老醫(yī)學(xué)問(wèn)題，而由燒傷、機(jī)械損傷和各類疾病等造成的皮膚缺損患者每年達(dá)上千萬(wàn)，因此，探索治療皮膚缺損的方法尋找合適的材料成為一個(gè)倍受研究人員關(guān)注的課題，而研制出具有生物活性的皮膚代替物，即皮膚再生支架，來(lái)永久性地代替受損皮膚在科研和臨床上都具有十分重要的意義[1-2].皮膚組織主要分為表皮層、真皮層和皮下組織3大部分.真皮層未缺損時(shí)，表皮層可以自動(dòng)修復(fù)，但一旦真皮層缺損，表皮層則無(wú)法再生.可見(jiàn)，真皮層的再生是皮膚組織再生的前提和核心.組織工程技術(shù)的發(fā)展[3]，為皮膚缺損修復(fù)研究開(kāi)辟了一條新的路徑，近年來(lái)，研究人員采用各類可降解材料作為支架材料，已制備出具有永久替代性并引導(dǎo)創(chuàng)傷面組織再生的人工真皮[4-6].

目前，各種各樣的高分子材料被用作組織工程材料[7].皮膚真皮組織中，膠原是主要的細(xì)胞外基質(zhì)，以膠原為基體材料構(gòu)建人工真皮是較理想的研究方案[8-10].由于膠原作為一種具有良好的生物相容性的可降解材料，而被廣泛應(yīng)用于組織工程及醫(yī)藥領(lǐng)域中[11-13].膠原基真皮支架的構(gòu)建方法有很多種，其中，基于熱致相分離原理的冷凍干燥法是最常見(jiàn)也是用于本實(shí)驗(yàn)的方案.然而，真皮支架制備過(guò)程中，支架的第二組分、支架孔徑和孔隙率、支架厚度以及交聯(lián)度等因素對(duì)支架的各種性能都起著至關(guān)重要的影響，其中孔徑和形貌對(duì)其生物活性有比較大的影響[14].Doillon等[15]通過(guò)調(diào)節(jié)冷凍干燥溫度及制備過(guò)程中pH值獲取理想的孔徑和形貌結(jié)構(gòu)；Garg等[16]討論了第二組分對(duì)膠原基真皮支架結(jié)構(gòu)的影響.在此基礎(chǔ)上，本研究旨在討論離心力在制備過(guò)程中對(duì)支架結(jié)構(gòu)形貌以及性能產(chǎn)生的影響，同時(shí)，通過(guò)對(duì)上中下3層結(jié)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)形貌和生物性能表征得出相關(guān)結(jié)論.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用的試劑包括:膠原(質(zhì)量濃度為0.37%)，透明質(zhì)酸(HA)，膠原酶(SigmaC0130)，冰乙酸(分析純)，其他所用試劑均為分析純.

實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:高速離心機(jī)(SIGMA 3-18K)，冷凍干燥機(jī)(Scientz-10N)，-80℃冰箱(SANYO/MDF-32V)，掃描電子顯微鏡(Mira3 Xmh，TESCAN)，恒溫?fù)u床(FLY-100B).

1.2 真皮支架的制備

膠原/透明質(zhì)酸真皮支架采用采用離心—冷凍法結(jié)合冷凍干燥法制備，其制備過(guò)程為:稱量膠原蛋白0.46 g于100 mL燒杯中，加入0.05 mol/L醋酸溶液49.54 g，攪拌溶解24 h(攪拌速度控制在400～500 rpm)；配制1.5%的透明質(zhì)酸水溶液，并在攪拌的過(guò)程中，將透明質(zhì)酸水溶液慢速加入上述膠原溶液中；復(fù)合溶液置于10 Pa、室溫下真空箱中脫泡10 min，裝入50 mL離心管中，5 000 rpm、-20℃條件下離心15 min，取出，放入-80℃冰箱進(jìn)行冷凍3 h，開(kāi)啟冷凍干燥機(jī)進(jìn)行制冷至-45℃；取出樣品放入冷凍干燥機(jī)，抽真空至10 Pa，冷凍干燥72 h得到膠原基真皮結(jié)構(gòu).

1.3 真皮支架材料孔隙率測(cè)定

用手術(shù)刀從所制備的真皮支架上切取上中下三部分，制成3個(gè)0.5 cm3平行樣的樣品，稱量其重量G1.然后，分別浸泡在裝有異丙醇的培養(yǎng)皿中，異丙醇沒(méi)過(guò)樣品，使樣品充分吸收異丙醇，浸泡12、24、48 h 3個(gè)時(shí)間段.將飽和試樣放進(jìn)銅絲網(wǎng)籃，懸掛在注滿異丙醇的燒杯中，稱量飽和試樣在異丙醇中的重量G3.從燒杯中取出試樣，用飽含異丙醇的多層紗布將試樣表面過(guò)剩的異丙醇擦掉(注意不壓到試樣，從而吸出空隙中的異丙醇溶液)，迅速稱量飽和試樣在空氣中的重量G2.

根據(jù)下列公式(1)和公式(2)分別計(jì)算試樣的顯孔隙率和容重.式中，q為試樣的顯孔隙率，DV為試樣的容重，G1為干燥支架試樣重量，G2為飽和支架試樣在空氣中質(zhì)量，G3為含飽和異丙醇的支架試樣重量.

1.4 真皮支架孔結(jié)構(gòu)表征

分別取干燥的真皮支架試樣上中下3組分直接粘在制樣模具導(dǎo)電膠上，真空條件下噴金，用SEM(Mira3 Xmh，TESCAN)在5.0 kV電壓下觀察其形貌.

1.5 真皮支架材料的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程是:

1)分別取真皮支架試樣上中下3組分4份鋪于培養(yǎng)皿中，75%酒精浸泡過(guò)夜，用PBS洗滌3次，將材料放于鋪有1%瓊脂糖的24孔板中.

2)將35 μ L ROS1728大鼠成骨細(xì)胞懸液滴加至試樣表面，含5×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞代數(shù)為第21代，培養(yǎng)3 h后每孔加入1 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后將試樣移至新孔 ，用PBS 洗 3次.取 10 μ L Calcein-AM 儲(chǔ)備液和15 μ L PI儲(chǔ)備液至5 mL PBS中配成熒光染液，利用Calcein-AM和PI分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色.每份材料加入1mL染色液，37℃孵育15min.吸去染色液，用PBS洗3次.進(jìn)行熒光觀察.綠色熒光為活細(xì)胞，紅色熒光為死細(xì)胞.

2 結(jié) 果

2.1 真皮支架形貌結(jié)構(gòu)

真皮支架上中下3組分的SEM形貌圖如圖1所示.

圖1 真皮支架上中下3組分的SEM形貌圖

從圖1可以明顯看出，真皮支架的中層結(jié)構(gòu)孔徑比上下層都大一些，結(jié)構(gòu)比較疏松，成孔成絲的結(jié)構(gòu)占大部分，而上下層支架結(jié)構(gòu)比較成片狀.同時(shí)，從上中下3層結(jié)構(gòu)的100倍SEM圖可以看出，從上到下層支架結(jié)構(gòu)越發(fā)交織錯(cuò)亂，說(shuō)明離心力使得支架結(jié)構(gòu)交聯(lián)，進(jìn)而得到致密的結(jié)構(gòu).

2.2 真皮支架孔徑分析

真皮支架孔徑分布如圖2所示.

圖2 真皮支架結(jié)構(gòu)上中下3層孔徑分布

從圖2可看出，在離心力作用下所得到的真皮支架的中層結(jié)構(gòu)孔徑最大，而底層結(jié)構(gòu)相對(duì)比較致密，同時(shí)中間層的孔徑分布較為狹窄.

2.3 真皮支架結(jié)構(gòu)孔隙率分析

真皮支架結(jié)構(gòu)孔隙率和容重如圖3與圖4所示.

圖3 浸泡不同時(shí)間段后的真皮支架3層的孔隙率

圖4 浸泡不同時(shí)間段后的真皮支架3層的容重

由圖3可看出，在膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的情況下，離心力使膠原真皮支架產(chǎn)生孔徑梯度，使得支架材料中部顯孔隙率相對(duì)較小，而底部的顯孔隙率相對(duì)較大.而從圖4可看出，真皮支架容重從上層至下層呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明從上到下支架層壁的厚度呈增加趨勢(shì).同時(shí)，支架材料浸泡在不同時(shí)間段后所呈現(xiàn)的規(guī)律基本不變，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，浸泡時(shí)間對(duì)支架材料結(jié)構(gòu)的孔隙率和容重沒(méi)有直接影響.

2.4 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

成纖維細(xì)胞在真皮支架上中下3層結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)72 h后的熒光染色圖如圖5所示.

圖5 真皮支架結(jié)構(gòu)上中下3層上成纖維細(xì)胞黏附生長(zhǎng)情況熒光圖

從圖5可看出，A、B、C圖中都可以看到材料表面有綠色的熒光，這些是存活的細(xì)胞，表明材料能促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，細(xì)胞相容性良好，上中下3層的細(xì)胞密度沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明該梯度結(jié)構(gòu)支架各層均適宜細(xì)胞的黏附生長(zhǎng).

3 結(jié) 語(yǔ)

采用離心—冷凍法結(jié)合冷凍干燥法所制得的真皮支架，由于制備過(guò)程中離心力的影響，支架上中下3層呈現(xiàn)出不同的三維結(jié)構(gòu)，具體表現(xiàn)在孔徑上:上層孔徑 ，52 ±27.8 μ m ，中層孔徑 ，57 ±8.7 μ m ，下層孔徑 ，49±40.4 μ m ，其中 ，下層結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，同時(shí)孔徑較小，但孔徑分布較為分散；而中層最為用孔壁的分析結(jié)果，孔徑大，但孔徑大小較為集中.支架細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明，支架各層結(jié)構(gòu)均利于細(xì)胞的粘附生長(zhǎng).本研究證實(shí)了真皮支架在制備過(guò)程中離心力產(chǎn)生了梯度孔結(jié)構(gòu)，但支架各層的生物相容性未產(chǎn)生顯著差異，均有良好的生物相容性.研究也證實(shí)，離心—冷凍法結(jié)合冷凍干燥法是一種制備梯度孔徑結(jié)構(gòu)材料的一種有效方法.

:

[1]Griffith L G，Naughton G.Tissue Engineering—Current Challenges and Expanding Opportunities[J].Science，2002，295(5557):1009-1014.

[2]Hutmacher D，Goh J，Teoh S.An Introduction to Biodegradable

Materials for Tissue Engineering Applications[J].Annals of the Academy of Medicine，Singapore，2001，30(2):183.

[3]Freed L E.Biodegradable PolymerScaffolds for Tissue Engineering[J].Nature Biotechnology ，1994，12(7):689-693.

[4]Mcinlf B，Sheep W.Design Principles for Composition and Performance of Cultured Skin Substitutes[J].Burns，2001.15(27):523-533.

[5]Ma L.Collagen/Chitosan PorousScaffolds with ImprovedBiostability for Skin Tissue Engineering[J].Biomaterials，2003，24(26):4833-4841.

[6]Widmer M S，Mikos A.Fabrication of Biodegradable Polymer Scaffolds for Tissue Engineering[M].New York:Elsevier Sciences，1998.

[7]Eisenbarth E.Biomaterials for Tissue Engineering[J].Advanced Engineering Materials，2007，9(12):1051-1060.

[8]Chevallay B，Herbage D.Collagen-based Biomaterials as3D Scaffold for Cell Cultures:Applications for Tissue Engineering and Gene Therapy[J].Medical and Biological Engineering and Computing ，2000，38(2):211-218.

[9]Ma J.APreliminary in VitroStudy on theFabrication and TissueEngineering Applications of a Novel Chitosan Bilayer Material as a Scaffold of Human NeofetalDermal Fibroblasts[J].Biomaterials，2001，22(4):331-336.

[10]Gao C.Materials and Structure Design of Artificial Dermis Equivalent Based on Collagen[J].Journal of Biomedical Engineering，2002，19(1):127.

[11]Park J S.Characterization and Structure Analysis of PLGA/Collagen Nanofibrous Membranes by Electrospinning[J].Journal of Applied Polymer Science，2012，125(S2):E595-E603.

[12]Schofer M D.Functionalisation of PLLANanofiber ScaffoldsUsing a Possible Cooperative Effect Between Collagen Type I and BMP-2:Impact on Colonization and Bone Formation in Vivo[J].Journal of MaterialsScience:Materials inMedicine，2012 ，22(7):1753-1762.

[13]Ferreira A M.Collagen for Bone Tissue Regeneration[J].Acta Biomaterialia，2012，8(9):3191-3200.

[14]Dagalakis N.Design of an Artificial Skin.Part III.Control of Pore Structure[J].Journal of Biomedical Materials Research，1980，14(4):511-528.

[15]Doillon C.Collagen Based Wound Dressings:Control of the Pore Structure and Morphology[J].Journal of Biomedical Materials Research，1986，20(8):1219-1228.

[16]Garg A K.Effect of Proteoglycans on Type I Collagen Fibre Formation[J].Biomaterials，1989，10(6):413-419.

Dermis Scaffold of Gradient Pore Structure Fabricated by Centrifugal-freeze Method

WANGMingbo1，WANGJun1，TAN Rongwei2，SHE Zhending1

(1.Key Laboratory for Biological Medical Material and Implantable Device，Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shenzhen 518057，China；2.Shenzhen Lando Biological Material Limited Company，Shenzhen 518057，China)

There are many factors controlling the microstructure and properties of collagen-based dermis scaffold，such as other main materials，the pore diameter and porosity aswell as the cross-linking density.Dermis scaffold of gradient pore structure was fabricated by combination of centrifugal-freeze method and freeze-drying method.The pore diameter and porosity of the scaffoldwere investigated by scanning electron microscope.Biocompatibility and cell adhesion properties of the scaffold were tested by experiment of cell culture growth to characterize the influence of centrifugal force.The results show that the centrifugal force has important influence on the microstructure of dermis scaffold with different degree of densification from the bottom up on the three layers and the pore diameters are different from each other，like the upper is 52±27.8 μ m ，the middle is 57 ±8.7 μ m and the lower is 49 ±40.4 μ m.Moreover，the results of cell adhesion experiment show that the lower layer is more suitable for the adhesion and growth of cell among the three different structures.

dermis scaffold；centrifugal force；biocompatibility

R318.08

A

1004-5422(2012)04-0305-04

2012-09-28.

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010B090400324)，深圳市生物、互聯(lián)網(wǎng)、新能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)基金(CSB2010C5260047A)資助項(xiàng)目.

王明波(1976—)，男，博士，副主任研究員，從事生物活性因子及藥物緩釋與相關(guān)材料研究.