鄒莉 譚昀 楊民寶 孫婷婷

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

樺褐孔菌(Inonotus obliguus(Pers.:Fr.)Pilát)屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，是一種重要的藥用真菌[1]。民間廣泛用于防治消化道疾病、心血管疾病和腫瘤(胃癌、腸癌及肝癌)等[2]，臨床上用于治療糖尿病、高血壓、癌癥、衰老、傳染性病毒等，取得顯著的效果[3]。樺褐孔菌成分復雜，含有多糖、三萜類化合物、葉酸衍生物、芳香族香草酸、生物堿等活性物質(zhì)[4－5]?；瘜W研究表明，多糖、香草酸、生物堿有抑菌活性[6－7]。有關(guān)真菌的活性成分在病原菌防治方面的研究主要以木霉為主[8]，木霉的抑菌作用及機制已被廣泛研究[9]，而關(guān)于樺褐孔菌的抑菌研究少見報道。為探索樺褐孔菌的活性物質(zhì)對植物病原菌的影響，拓展其應用領(lǐng)域，筆者對其抑菌效果及對病原菌孢子萌發(fā)的影響進行了研究，為樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌由東北林業(yè)大學林學院森林微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基:PDA 固體培養(yǎng)基[10]46－47，PD 液體培養(yǎng)基[10]46－47。所有培養(yǎng)基在 121 ℃ 下滅菌 30 min備用。

供試植物病原菌:楊樹爛皮病菌(Cytospora chrysosperma)、落葉松枯梢病菌(Botryosphaeria laricina)由東北林業(yè)大學林學院森林保護學科病理實驗室提供;玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、番茄褐斑病菌(Helminthosporium carposaprum)、番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)由東北農(nóng)業(yè)大學植物保護學科提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 樺褐孔菌不同發(fā)酵時間發(fā)酵產(chǎn)物抑菌率的測定

將樺褐孔菌液體種子以20%的接種量，接入200 mL液體PD培養(yǎng)基中，150 r/min，25℃避光培養(yǎng) 9、12、15、17、19、20、23、25、27、29 d。采用菌絲生長速率法[10]141測定樺褐孔菌不同發(fā)酵時間的發(fā)酵產(chǎn)物對7種供試病原菌的抑制作用:將200 μL的發(fā)酵產(chǎn)物加入每個PDA培養(yǎng)基，對照加入無菌水，用直徑6 mm的打孔器在各病原菌活化后的培養(yǎng)基上打孔取菌餅，接入上述培養(yǎng)皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h觀察1次，用十字交叉法測量菌落直徑，每處理設3次重復，計算樺褐孔菌不同發(fā)酵時間的發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑菌率。

抑菌率=[(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.2.2 樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物活性物質(zhì)提取

1.2.2.1 菌絲體的活性物質(zhì)提取

將抑菌率最高的發(fā)酵液離心分離菌絲體，將菌絲體沖洗干凈后60℃烘干，粉碎后過60目篩備用。①菌絲體粉末的抑菌活性測定:將預處理的菌絲體粉末按比例加入PDA培養(yǎng)基中，高溫濕熱滅菌，接入病原菌，以不加菌絲體粉末的PDA平板培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)72 h。測定菌絲體粉末的抑菌活性。②菌絲體有機溶劑萃取物的抑菌活性測定:將經(jīng)過預處理的菌絲體用正丁醇和乙酸乙酯在78℃下進行索氏抽取8 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥后用丙酮配置成一定濃度的樣品液，濾膜過濾除菌后采取平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性測定。③菌絲體水溶多糖的抑菌活性測定:取1 g干菌絲體粉末加定量熱水浸提，浸提液合并后濃縮至原體積的1/4，下層清液置透析袋，蒸餾水透析2 d，流水透析1 d，用3倍95%乙醇沉淀[12]，沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得菌絲體水溶性粗多糖。將收集到的菌絲體水溶性粗多糖按比例溶解在無菌蒸餾水中，用無菌濾膜過濾，制成水溶性粗多糖溶液，采用平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性的測定。

1.2.2.2 發(fā)酵液的活性物質(zhì)提取

發(fā)酵上清液直接抑菌活性測定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液不經(jīng)任何處理，用平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性測定。

高溫高壓滅菌發(fā)酵上清液的抑菌活性測定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌后，采用平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性測定。

發(fā)酵上清液有機溶劑萃取物的抑菌活性測定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液減壓濃縮至原來體積的1/2，分別用5倍體積的正丁醇，3倍體積的乙酸乙酯進行萃取，萃取時間為24 h。之后用分液漏斗分離萃取相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得固體樣品，真空干燥后用丙酮配置成一定濃度的樣品液。濾膜過濾除菌后采取平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性測定。

發(fā)酵上清液醇提物的抑菌活性測定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液加入3倍體積的95%乙醇，4℃下靜止12 h，有絮狀沉淀出現(xiàn)，冷凍干燥得到沉淀物，然后放置于干燥器中進一步干燥，得到發(fā)酵上清液醇提物干品。將醇提物用無菌水按比例溶解，用無菌濾膜過濾，制成水溶性粗多糖溶液，采用平板表面涂抹法[11]進行抑菌活性測定。

1.2.3 樺褐孔菌發(fā)酵液抑菌活性多糖的純化及最小抑菌質(zhì)量濃度的測定

對抑菌率最高發(fā)酵周期的發(fā)酵液粗多糖進行分級純化，參照文獻[13－15]并加以調(diào)整，采用95%乙醇對粗多糖進行分級沉淀。取一定質(zhì)量粗多糖溶于適量的水中，邊攪拌邊加入95%的乙醇，使乙醇的最終體積分數(shù)為:30%、50%、70%、90%。在6000 r/min、4℃離心，收集沉淀，冷凍干燥沉淀得到分級醇沉的多糖干品。醇沉分級純化的多糖按乙醇最終體積分數(shù)分類，分別用無菌蒸餾水溶解配置成 50 g·L－1的粗多糖溶液，0.22 μm 無菌濾膜過濾。采用菌絲生長速率法，測定各級別多糖的抑菌率，比較抑菌率，篩選出抑菌活性最強的多糖，用半倍稀釋法[16]73、懸滴法[16]72測定抑菌活性多糖對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的最低抑制質(zhì)量濃度。以生物農(nóng)藥兒茶素作為影響菌絲生長的對照，以無菌水作為孢子萌發(fā)的對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌率最高的樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵周期

樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌的抑制活性見圖1。由圖1可知，樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對7種病原菌均有抑制作用，抑菌率隨著發(fā)酵時間的增加逐漸升高，至第23天發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性最強，到25 d后基本保持穩(wěn)定。因此，可以確定樺褐孔菌分離和純化抑菌活性物質(zhì)最佳發(fā)酵周期為23 d。樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期的發(fā)酵產(chǎn)物對楊樹爛皮病和落葉松枯梢病的抑菌率超過了50%，因此研究其發(fā)酵產(chǎn)物所含抑菌活性物質(zhì)對抑制楊樹爛皮病和落葉松枯稍病具有較大的經(jīng)濟價值。

圖1 Inonorus obliguus發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌的抑制活性的影響

2.2 樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物不同處理的抑菌率比較

樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期發(fā)酵產(chǎn)物的不同處理對楊樹爛皮病、落葉松枯稍病的抑菌活性比較如表1所示?？梢钥闯?，樺褐孔菌發(fā)酵上清液醇提物對楊樹爛皮病、落葉松枯稍病抑菌活性均較強，其次為發(fā)酵上清液、滅菌后的發(fā)酵上清液，其中發(fā)酵上清液不同處理的抑菌活性均強于化學試劑萃取組分，可見樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中的主要抑菌活性物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液的醇提物中。

表1 樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

2.3 樺褐孔菌抑菌活性多糖的分級純化

醇沉最終體積分數(shù)為30%、50%、70%、90%時 ，多糖得率分別為1.41% 、2.51% 、10.05% 、2.04%。不同醇沉體積分數(shù)多糖的得率區(qū)別較大，隨著醇沉最終體積分數(shù)的增大樺褐孔菌多糖的得率呈增加趨勢，當體積分數(shù)為70%時達到最高，之后隨著體積分數(shù)增大多糖得率逐漸減小。結(jié)果表明，樺褐孔菌的最佳醇沉體積分數(shù)為70%。

2.4 樺褐孔菌分級純化抑菌活性多糖的抑菌效果

不同醇沉級別的樺褐孔菌多糖對病原菌的抑菌率見表2。為了避免出現(xiàn)偏差，在對抑菌活性多糖分級后抑菌活性比較中將供試的7種病原菌都作了測試。結(jié)果表明:醇沉級別為70%的樺褐孔菌多糖(質(zhì)量濃度為50 g·L－1)對病原菌的抑菌率最高。70%的樺褐孔菌多糖對楊樹爛皮病和落葉松枯梢病抑菌率為供試組中最高的，分別為54.65%、67.41%。

表2 不同醇沉級別的樺褐孔菌多糖對病原菌的抑菌率%

2.5 樺褐孔菌多糖的最小抑菌質(zhì)量濃度

醇沉級別為70%的樺褐孔菌多糖對楊樹爛皮病和落葉松枯稍病菌絲生長的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為65、60 g·L－1;兒茶素對楊樹爛皮病和落葉松枯稍病菌菌絲生長的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為75、55 g·L－1，抑制效果見圖2和圖3。

醇沉級別為70%樺褐孔菌發(fā)酵液多糖對楊樹爛皮病孢子無明顯的抑制作用，對落葉松枯稍病的孢子有較明顯的抑制作用，當其質(zhì)量濃度為55 g·L－1時能抑制50%的孢子萌發(fā)(圖4)，這可能與病原菌孢子的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖2 樺褐孔菌最小抑菌質(zhì)量濃度對楊樹爛皮病的抑制效果

圖3 樺褐孔菌最小抑菌質(zhì)量濃度以及生物農(nóng)藥對落葉松枯稍病的抑制效果

圖4 樺褐孔菌對落葉松枯稍病孢子的影響以及無菌生理鹽水對照(右)

3 結(jié)論與討論

樺褐孔菌是目前抗癌研究領(lǐng)域的熱門藥用品種。到目前為止，對樺褐孔菌的研究大多集中在抗腫瘤和提高機體免疫能力方面，而關(guān)于樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性很少報道。本研究證明了它對7種植物病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有抑制作用。已證實，樺褐孔菌發(fā)酵上清液的乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有抑菌活性，其發(fā)酵上清液醇提物對楊樹爛皮病、落葉松枯稍病抑菌活性均較強，由此推斷，樺褐孔菌抑菌活性物質(zhì)主要存在于菌絲體醇提取物中。通過對活性成分的初步檢測，樺褐孔菌菌絲體甲醇、正丁醇提取物中主要含有多糖類物質(zhì)。因此，樺褐孔菌菌絲體中所含的多糖類物質(zhì)可能具有較高的抑菌活性。而發(fā)酵液所表現(xiàn)出來的抑菌作用可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類活性物質(zhì)有關(guān)，也可能是由于液體發(fā)酵時菌絲斷裂而產(chǎn)生抗生素或釋放出了抗生素物質(zhì)，對于樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用機制有待于進一步研究。由于病原菌只選用了7種，故不能確定其對未測試的病原菌有無抑制活性。

關(guān)于桑黃抑菌的研究已有過報導，2011年孟慶龍等研究了桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用[17]，試驗中選取的病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌，本研究在此基礎(chǔ)上擴展了樺褐孔菌對其他7種植物病原菌的抑制作用研究，對于樺褐孔菌活性物質(zhì)的提取方法，本研究也分別對發(fā)酵液和菌絲體采用了多種不同的試劑提取，得出的結(jié)果與孟慶龍的結(jié)論相似，但較之其研究有了進一步的深化。

多糖作為真菌的發(fā)酵產(chǎn)物之一，已有不少關(guān)于其抑菌活性的報導，例如靈芝多糖[18]，紅菇菌多糖[19]，粒毛盤菌和盤針孢菌多糖[20]等。在樺褐孔菌與生物農(nóng)藥的最小抑菌質(zhì)量濃度的對比中發(fā)現(xiàn):分離出的多糖是一類分子量相近、結(jié)構(gòu)不同的多糖混合物，如果分離出起主要抑菌作用的多糖分子，抑菌效果一定會大大提高。本試驗下一步將對樺褐孔菌菌株進行大量發(fā)酵，進一步優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，改進和優(yōu)化抑菌活性物質(zhì)的提取技術(shù)，從其代謝產(chǎn)物中分離和提取出具有殺菌活性成分的化合物，并對分離出的化合物進行活性測定和結(jié)構(gòu)鑒定，以進一步確定發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的組分及相應的化學結(jié)構(gòu)，以期能得到高活性的新化合物。

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