謝寅峰 張志敏 張穎穎 孫 朦 尚旭嵐 方升佐

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

青錢(qián)柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)又名搖錢(qián)樹(shù)、麻柳、青錢(qián)李等，系胡桃科(Juglandaceae)青錢(qián)柳屬植物，是我國(guó)特有的珍稀單種屬植物，國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物之一，青錢(qián)柳為多用途樹(shù)種，具藥用、材用和觀賞價(jià)值［1－2］。目前，現(xiàn)有的青錢(qián)柳資源主要是天然林，不僅數(shù)量少，而且多零星散布于深山老林和一些自然保護(hù)區(qū)中。青錢(qián)柳由于種子敗育并具有深休眠等諸多因素造成其繁殖較困難［3］，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)大量人工繁殖和栽培青錢(qián)柳的成功經(jīng)驗(yàn)，相關(guān)方面的研究報(bào)道也較少。愈傷組織可以作為研究植物脫分化和再分化、生長(zhǎng)和發(fā)育、遺傳和變異、育種及次生代謝物生產(chǎn)的理想材料［4］，因此獲得大量愈傷組織也成為目前開(kāi)發(fā)利用青錢(qián)柳資源的一個(gè)重要研究方向。

為了獲得大量狀態(tài)較好的青錢(qián)柳愈傷組織，本文在前期愈傷組織誘導(dǎo)研究的基礎(chǔ)上［5］，進(jìn)一步從基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、稀土應(yīng)用等方面對(duì)愈傷組織增殖條件進(jìn)行探討，研究結(jié)果為后續(xù)次生代謝調(diào)控、高效組培快繁體系建立等方面的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自江蘇鎮(zhèn)江南京林業(yè)大學(xué)教育基地。取3年生青錢(qián)柳幼樹(shù)當(dāng)年生的嫩枝作為外植體，以嫩葉作為誘導(dǎo)愈傷組織的材料。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見(jiàn)文獻(xiàn)［5］。

1.2 增殖基本培養(yǎng)基的篩選

采用單因素設(shè)計(jì)，采用WPM、改良DKW(硼酸減為1/3，VB1和甘氨酸增加1倍)、MS、改良 MS(3/4MS)、DY、B5等6種培養(yǎng)基進(jìn)行增殖試驗(yàn)。添加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L瓊脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)，pH調(diào)至5.8。每個(gè)處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，記錄愈傷的顏色狀態(tài)，20 d后收獲測(cè)鮮重增量和增長(zhǎng)率。

1.3 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

以改良MS 為基本培養(yǎng)基，添加20、30、40、60 g/L 蔗糖，附加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8。每個(gè)處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，記錄愈傷的顏色狀態(tài)，20 d后收獲測(cè)鮮質(zhì)量增量和增長(zhǎng)率。

1.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

增殖培養(yǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)及其濃度，采用 KT、2，4－D、NAA 三因素［6］，三水平 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，KT 分別為 0.2、0.5、1.0 mg/L，2，4－D分別為0.2、1.0、2.0mg/L，NAA分別為0.0、0.1、1.0 mg/L。以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8。每處理接種5瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，20 d后收獲測(cè)鮮重增量和增長(zhǎng)率。

1.5 稀土對(duì)愈傷組織增殖的動(dòng)態(tài)影響

以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的稀土(硝酸鑭，La(NO3)3)。質(zhì)量濃度梯度分別設(shè)為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、50 mg/L。附加 2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L 瓊脂，pH 調(diào)到5.8。每個(gè)處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后在20 d后測(cè)愈傷組織生長(zhǎng)量，統(tǒng)計(jì)增長(zhǎng)率，記錄愈傷的顏色狀態(tài)。

1.6 觀察、統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

愈傷組織增長(zhǎng)量和增長(zhǎng)率用鮮質(zhì)量增加計(jì)算法(g/瓶):

以上數(shù)據(jù)為6瓶的平均值，重復(fù)3次。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel，STST統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，并用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織增殖的影響

表1結(jié)果顯示，不同基本培養(yǎng)基對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織的增值和生長(zhǎng)有不同程度的影響。生長(zhǎng)量增量最大的是MS培養(yǎng)基，其次為WPM和改良DKW，差異不顯著(p＞0.05);從增長(zhǎng)率來(lái)看，WPM培養(yǎng)基最佳，其次是改良DKW和MS，差異不顯著(p＞0.05);但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，MS和改良MS效果最好，大多為淡綠色，質(zhì)地較松散，WPM培養(yǎng)基的愈傷組織部分出現(xiàn)褐色，質(zhì)地較硬。綜合以上3個(gè)因素，MS培養(yǎng)基為最佳選擇。

2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

表2結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加20～60 g/L的蔗糖，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織生長(zhǎng)量的增量和增長(zhǎng)率均呈下降的趨勢(shì)，20 g/L時(shí)增長(zhǎng)率最高，60 g/L時(shí)增長(zhǎng)率最低，20 g/L處理與其它質(zhì)量濃度處理間差異顯著。但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)效果最佳，淡綠色，質(zhì)地較松散，有利于繼代培養(yǎng)。

表1 基本培養(yǎng)基對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織增殖的影響

表2 不同質(zhì)量濃度的蔗糖對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織增殖的影響

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素及濃度配比對(duì)青錢(qián)柳葉片愈傷組織的增殖有不同程度的影響作用。其中，KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L組合效果最佳，平均增量和增長(zhǎng)率都達(dá)到最高，分別為3.48 g和1024.51%，和其他處理相比均達(dá)極顯著差異(p＜0.01)。極差分析結(jié)果表明，三因素(KT、2，4－D、NAA)的 R 值分別為 267.74、346.08、103.34，說(shuō)明三種激素對(duì)愈傷組織增殖的影響效果為2，4－D＞KT＞NAA，2，4－D 為影響增殖效果的主導(dǎo)因素。從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，隨著2，4－D質(zhì)量濃度的增大，愈傷組織分裂快、質(zhì)地疏松，但平均增量和增長(zhǎng)率明顯下降，愈傷組織顏色由淡黃、白等淺色逐漸加深成褐、黑色。KT質(zhì)量濃度高時(shí)愈傷組織較致密，顏色鮮嫩。綜合各組合測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的增殖不僅與植物生長(zhǎng)激素的絕對(duì)量有關(guān)，還與生長(zhǎng)激素與細(xì)胞分裂素的比例有關(guān)。當(dāng)生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素為1∶1左右時(shí)(如組合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 和 KT1.0 mg/L+2，4－D1.0 mg/L)，愈傷組織的增長(zhǎng)量較大;當(dāng)生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素為2 ∶1 左右時(shí)(如組合 KT1.0 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L)，愈傷組織的增長(zhǎng)量(0.45 g)及增長(zhǎng)率(108.80%)最低，和其它處理相比達(dá)極顯著差異(p＜0.01)。

2.4 稀土對(duì)愈傷組織增殖的影響

表3結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中添加鑭稀土質(zhì)量濃度的增加，對(duì)愈傷組織增殖的影響總體上呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的效應(yīng)。當(dāng)鑭稀土質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織的增殖效果最佳，和其他處理相比均達(dá)顯著差異(p＜0.05)。隨著鑭稀土質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織增長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，鑭稀土質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)效果最佳，淡綠色，質(zhì)地較松散，有利于繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的稀土能有效促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，而濃度過(guò)高則對(duì)愈傷組織的增殖起抑制作用。

表3 鑭稀土對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織增殖的影響

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，基本培養(yǎng)基的種類(lèi)對(duì)愈傷組織的增殖產(chǎn)生一定的影響［7］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然從愈傷組織增長(zhǎng)率來(lái)看，WPM培養(yǎng)基最佳。但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，MS和改良MS效果最好，大多為淡綠色，質(zhì)地較松散;而WPM培養(yǎng)基的愈傷組織部分出現(xiàn)褐色，質(zhì)地較硬。

蔗糖是大多數(shù)植物細(xì)胞生長(zhǎng)的最適碳源，它的吸收和利用直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。在B5培養(yǎng)基中添加2%的蔗糖最適合東北紅豆杉愈傷組織增殖，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)旺盛。以不同質(zhì)量濃度蔗糖作為碳源進(jìn)行茶細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，隨著蔗糖含量的增加，愈傷組織生長(zhǎng)逐漸上升，到6%時(shí)生長(zhǎng)最好，隨后下降［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織生長(zhǎng)亦有明顯的影響，質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)效果最佳，增長(zhǎng)率達(dá)175.47%;隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大愈傷組織生長(zhǎng)量的增量和增長(zhǎng)率明顯下降，分析原因可能是高質(zhì)量濃度蔗糖引起了培養(yǎng)基高滲，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。這與李毅［9］的蔗糖質(zhì)量濃度大小與愈傷組織增長(zhǎng)量成正比的結(jié)論不同。

各種植物激素質(zhì)量濃度及配比對(duì)愈傷組織增殖及繼代時(shí)的狀態(tài)、褐化起一定的促進(jìn)作用。王立強(qiáng)［10］報(bào)道，愈傷組織繼代時(shí)高質(zhì)量濃度生長(zhǎng)素使組織松散極易褐化，繼代后難以存活，甚至有時(shí)呈爛泥狀;高質(zhì)量濃度分裂素使愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，繼代時(shí)不易褐化死亡。并發(fā)現(xiàn)組合KT0.5mg/L+2，4－D 0.5 mg/L繼代苦豆子愈傷組織效果最好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同植物激素質(zhì)量濃度及配比對(duì)青錢(qián)柳愈傷組織的增殖有明顯的差別。其中組合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 效果最佳，平均增量和增長(zhǎng)率都達(dá)到最高，且顏色鮮嫩，結(jié)構(gòu)緊密呈顆粒狀，適于繼代培養(yǎng)。

稀土元素在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。低質(zhì)量濃度時(shí)可促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)，高質(zhì)量濃度時(shí)抑制生長(zhǎng)，更高質(zhì)量濃度時(shí)則使植物死亡，其作用與激素有許多相似之處［11］。魯寬科［12］等以藥用植物大黃的愈傷組織為研究對(duì)象，研究不同質(zhì)量濃度的稀土元素Eu對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度稀土元素Eu促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng).高質(zhì)量濃度則抑制生長(zhǎng)。杜紅梅等［13］報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加1～100 mg/L La(NO3)3明顯影響外植體的分化率、增殖倍數(shù)、幼苗的根數(shù)以及根系和莖葉中干物質(zhì)的積累，其中1 mg/L La(NO3)3處理效果最佳;而高質(zhì)量濃度(50～100 mg/L)La(NO3)3處理則顯著降低了外植體的分化率和增殖倍數(shù)。本研究表明，培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度(0.5 mg/L)的鑭稀土后，愈傷組織的生長(zhǎng)得到有效促進(jìn)。但難度過(guò)高則對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)起抑制作用，可能是由于代謝物的積累增加，使愈傷組織褐化而抑制生長(zhǎng)，有關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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