唐連飛，周智君，蔡婧怡，孟 芳，魏 穎，俞遠(yuǎn)京，蘇志杰

(1.湖南出入境檢驗檢疫局，長沙 410004;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部，長沙 410008)

鼠棒狀桿菌PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用

唐連飛1，周智君2，蔡婧怡1，孟 芳1，魏 穎1，俞遠(yuǎn)京2，蘇志杰2

(1.湖南出入境檢驗檢疫局，長沙 410004;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部，長沙 410008)

目的 建立鼠棒狀桿菌PCR檢測方法并應(yīng)用于臨床樣本檢測。方法 用腦心浸出液培養(yǎng)基復(fù)蘇、培養(yǎng)鼠棒狀桿菌(corynebacterium kutscheri，C.kutscheri)并提取基因組DNA作模板;根據(jù)GenBank中C.kutscheri的16S基因序列設(shè)計合成引物，建立鼠棒狀桿菌PCR檢測方法并進(jìn)行敏感性和特異性的評價;人工感染昆明鼠，建立小鼠棒狀桿菌感染模型，采集肝臟和腎臟，提取DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果 成功建立了鼠棒狀桿菌PCR檢測方法，該方法可檢測到100個陽性質(zhì)粒;對小鼠沙門氏菌、肺炎鏈球菌和巴氏桿菌無交叉反應(yīng);全部8個人工感染樣本全部檢測為陽性。結(jié)論 建立的鼠棒狀桿菌PCR檢測方法靈敏度高、特異性好，可作為鼠棒狀桿菌感染的快速檢測方法。

鼠棒狀桿菌;PCR檢測方法;16S核糖體RNA

棒狀桿菌屬細(xì)菌是一種人畜共患的多種型傳染病病原菌。鼠棒狀桿菌病呈世界性分布，特別是在常規(guī)鼠群中，隱性感染非常普遍，發(fā)病率和死亡率高，暴發(fā)流行時可導(dǎo)致動物群覆沒，在實驗動物的病原菌控制中是小鼠和大鼠病原菌必檢項目。目前國內(nèi)外對鼠棒狀桿菌的檢測研究很少，主要進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)［1－4］，國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T14926.9－2001規(guī)定也是進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)［5］，還有進(jìn)行血清學(xué)檢測的報道［6－7］。這些方法操作復(fù)雜、時間長、靈敏度低，容易造成漏檢。本實驗采用PCR技術(shù)，根據(jù)GenBank發(fā)表的鼠棒狀桿菌16S rRNA基因，設(shè)計了特異性引物，建立了準(zhǔn)確、快速檢測鼠棒狀桿菌PCR方法，并能很好地應(yīng)用于臨床樣本的檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

鼠棒狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(C.kutscheri，ATCC 11306)，購于美國模式菌種收集中心，小鼠肺炎鏈球菌、沙門菌和巴氏桿菌由湖南出入境檢驗檢疫局保存。用腦心浸出液對C.kutscheri菌種進(jìn)行復(fù)蘇、傳代和液體培養(yǎng)。細(xì)菌用250mL錐形瓶于37℃、200 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2 細(xì)菌DNA提取

取10mL過夜培養(yǎng)液5000 rpm離心10 min，去上清液。加1mL TE懸浮沉淀，并加0.1mL 20%SDS，50 μL 10mg/mL蛋白酶 K，混勻，55℃孵育1 h。加 0.2mL 5 mol/L NaCl，0.2mL CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃孵育20 min。加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，12000 rpm 離心 10 min，將上清液移至干凈離心管。用等體積氯仿:異戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液移至干凈管中。加1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10 min。12000 rpm離心10 min，棄上清。70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于0.1mLTE，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與PCR反應(yīng)

根據(jù)表1中C.kutscheri 16S rRNA基因序列，利用Primer Express 3引物設(shè)計軟件來設(shè)計引物，寶生物(大連)有限公司合成。引物和序列如下:上游引物:GCAACGCGAAGAACCTTACC，下游引物:CCCG GCAGTCTCTCATGAGT，擴增片段大小為200 bp。

表1 引物和探針設(shè)計時所參照的菌株Tab.1 Strains used for designing primers and probe for C.kutscheri detection

1.4 PCR擴增體系及退火溫度篩選

采用 GoTaq?Green Master Mix(promega)PCR試劑盒，體系如下:

擴增條件為:94℃ 預(yù)變性5 min;按以下條件進(jìn)行 30 個循環(huán)擴增:94℃ 40 s，48℃～56℃ 40 s，72℃40 s;最后 72℃延伸 5 min。溫度梯度 PCR儀為Biometra TGradient。

1.5 陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

1.5.1 模板擴增:按 1.4對提取的 C.kutscheri ATCC 11306 DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴增，退火溫度選擇1.4中最佳退火溫度。

1.5.2 PCR產(chǎn)物純化和克隆:將 PCR產(chǎn)物用TaKaRa(大連)公司DNA純化試劑盒純化并連接到pGEM?-T Easy載體(Promega)上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109。經(jīng)LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板藍(lán)白篩選后挑取重組成功的白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，用TaKaRa(大連)公司小批量質(zhì)粒DNA純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.5.3 重組質(zhì)粒鑒定:以質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴增鑒定是否重組成功。

1.6 方法敏感性的分析 測定提取質(zhì)粒的濃度，計算每微升質(zhì)粒中的分子數(shù)。將質(zhì)粒稀釋使其在2μL 中分別含有 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、101拷貝數(shù)。按1.4進(jìn)行PCR擴增，退火溫度選擇1.4中最佳退火溫度。

1.7 方法的特異性分析 按1.4方法以C.kutscheri、小鼠肺炎鏈球菌、小鼠沙門菌和巴氏桿菌的DNA為模板，確定方法的特異性。

1.8 鼠棒狀桿菌感染模型建立及樣本采集 按每只5×106個細(xì)菌量通過腹腔注射方法分別感染4只SPF級昆明小鼠，發(fā)病后采集肝臟和腎臟，按標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行分離培養(yǎng)和常規(guī)方法提取組織 DNA。SPF級昆明小鼠來源于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司(SCXK(湘)2011－0003)，體重為 18～22g，在中南大學(xué)實驗動物學(xué)部進(jìn)行實驗(SYXK(湘)2011－0001)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增和退火溫度的篩選 以C.kutscheri(ATCC11036)DNA為模板，采用48℃～56℃的退火溫度，成功擴增出與預(yù)期大小一致的200 bp的條帶;在不同退火溫度(55.2、54.3、53.4、52.4、51.5、50.5、49.6、48.7)下均能擴增出目的條帶，但在以54.3℃最好(圖1)，因此選擇54℃作為本方法的最佳退火溫度。

圖1 溫度梯度PCR擴增Fig.1 Temperature gradient PCR amplification

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示產(chǎn)物大小與目的插入片段大小一致，重組成功(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 Identification of the recombined plasmid

2.3 不同模板拷貝數(shù)的PCR擴增 在反應(yīng)體系中分別加入、1×104、1×103、1×102、1× 101、1× 100拷貝數(shù)的質(zhì)粒時，1×104、1×103、1×102可見特異性產(chǎn)物，顯示本方法檢測低限為1×102拷貝(圖3)。

2.4 檢測方法的特異性分析 利用建立的方法對小鼠沙門菌、肺炎鏈球菌和巴氏桿菌DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示方法對小鼠沙門菌、肺炎鏈球菌和巴氏桿菌無交叉反應(yīng)，未出現(xiàn)擴增條帶，只檢測出鼠棒狀桿菌(圖4)。

圖3 不同模板拷貝數(shù)的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of different copies of the target gene

圖4 方法的特異性檢測Fig.4 Results of specificity test

2.5 小鼠棒狀桿菌模感染型建立及樣本采集和檢測 小鼠注射7 d后全部發(fā)病，出現(xiàn)被毛逆立，精神萎靡不振，12 d時全部死亡，小鼠肝臟和腎臟出現(xiàn)化膿性壞死灶。取死亡小鼠的肝臟和腎臟病灶進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法檢測均為陽性。

3 討論

目前鼠棒狀桿菌的檢測主要包括2種方法:分離鑒定和血清學(xué)檢測［1－7］，還沒有利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測的研究報道。與細(xì)菌分離鑒定和血清學(xué)檢測相比，PCR方法具有操作簡單、特異性強、靈敏度高和檢測時間短等優(yōu)點。本研究根據(jù)鼠棒狀桿菌16S rRNA的核酸序列，設(shè)計的引物能特異性的擴增出大小200 bp的DNA條帶(圖1)，而對小鼠沙門氏菌、肺炎鏈球菌和巴氏桿菌無交叉反應(yīng)(圖4);以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行靈敏度試驗的結(jié)果表明建立的方法體系能夠檢測到100個拷貝的模板DNA，具有較高的敏感性。通過對試驗感染樣本的檢測，8個樣本全部為陽性，顯示本方法可以很好的應(yīng)用與臨床病變組織樣本的檢測。

16S rRNA基因在其堿基組成、核苷酸序列、高級結(jié)構(gòu)及生物功能等方面表現(xiàn)出進(jìn)化上的高度保守性，被廣泛用于物種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究工作中［8］，本研究利用鼠棒狀桿菌的16S rRNA基因?qū)ζ溥M(jìn)行檢測鑒定。

鼠棒狀桿菌能在機體抵抗力下降時導(dǎo)致大鼠和小鼠發(fā)病甚至死亡，也影響實驗結(jié)果的解釋及評價，因此在實驗動物微生物等級及監(jiān)測中是大鼠和小鼠的必檢項目，必須為陰性［9］。常規(guī)的檢測方法都是從氣管分泌物和回盲段內(nèi)容物中對棒狀桿菌進(jìn)行直接分離培養(yǎng)，這種方法在隱性感染小鼠中的檢出率分別為1%和3%，在誘發(fā)感染發(fā)病小鼠中的檢出率也只有19%和12%的，對自然發(fā)病的小鼠檢出率為22%和0［10］，可見直接從氣管分泌物和腸道內(nèi)容物中分離培養(yǎng)的方法不適合對小鼠棒狀桿菌監(jiān)測和檢測。通過選擇性培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后有可能提高檢出率［11－12］。

在小鼠棒狀桿菌病中內(nèi)臟表現(xiàn)為廣泛性的化膿性病變，尤其是肝和腎的病變最為明顯［13］，因此，本實驗以肝臟和腎臟作為檢測對象來探討所建立的方法的適用性。結(jié)果表面，對病變肝臟和腎臟，PCR方法和分離培養(yǎng)方法都能檢出，但PCR方法操作更簡單，所需時間更短。對其他臨床樣本的適用性有待于通過與培養(yǎng)方法的比較來進(jìn)一步研究證實。

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Development and Application of a PCR for the Detection of Corynebacterium Kutscheri in Mice

TANG Lian-fei1，ZHOU Zhi-jun2，CAI Jing-yi1，MENG Fang1，WEI Ying1，YU Yuan-jing2，SU Zhi-jie2
(1.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha 410004，China;2.Department of Laboratory Animal of Xiangya Medicine School，Centre South University，Changsha 410008，China)

Objective To develop a PCR for the detection of corynebacterium kutscheri(C.kutscheri)and apply it to clinical samples.Methods Genomic DNA was extracted as template for PCR from C.kutscheri(ATCC 11306)recoveried and cultivated in brain heart infusion medium.According to the C.kutscheri 16S rRNA gene sequence available in GenBank a pair of primes were designed and synthesized in order to develop a PCR for detection of C.kutscheri.After evaluated for sensitivity and specificity the PCR method was applied to detect the C.kutscheri in clinical livers and kidneys of mice artificially infected with C.kutscheri.Results The PCR for the detection of C.kutscheri was developed successfully and were specific enough to distinguish C.kutscheri from salmonella，streptococcus pneumoniae and Pasteurella.A minimum of 100 positive plasmids could be detected，indicating a good sensitivity of the assay.Conclusion This method repoted here is specific，sensitive and provides a fast detection of C.kutscheri and could be used for C.kutscheri clinical diagnosis.

Corynebacterium kutscheri;PCR method;16S rRNA

S858.91

A

1671-7856(2012)09-0051-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.011

2012-08-17

湖南省科技廳科技項目資助(2011TT2016)。

唐連飛(1970－)男，高級獸醫(yī)師，博士，病原生物學(xué)。

周智君(1971－)女，高級實驗師，碩士，實驗動物學(xué)。