張才科，白 靜，余 慧，沈正華，樂國偉

江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122

槲皮素體外抗氧化及對小鼠血脂代謝作用的研究

張才科，白 靜，余 慧，沈正華，樂國偉*

江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122

本研究旨在探討槲皮素體外抗氧化能力以及對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響。體外分別測定了槲皮素對DPPH·，·OH和ABTS+·自由基的清除作用。動物實驗:將昆明種雄性小鼠32只，隨機分為4組，分別飼喂正常、高脂、高脂+0.05 g/kg槲皮素、高脂+0.1 g/kg槲皮素日糧。9周后測定小鼠肝臟活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、抗氧化酶活力及血脂水平。結(jié)果表明:槲皮素對DPPH·，·OH和ABTS+·具有較強的清除作用，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的劑量增加-效應(yīng)增強的關(guān)系。0.05 g/kg槲皮素能顯著降低肝臟自由基水平及MDA含量(P＜0.05)，增強抗氧化能力(P＜0.05)，改善血脂水平(P＜0.05)，而0.1 g/kg槲皮素效果不顯著。結(jié)論:0.05 g/kg槲皮素可有效提高機體抗氧化能力，緩解高脂膳食造成的氧化應(yīng)激，改善血脂代謝。

槲皮素;高脂日糧;氧化應(yīng)激;抗氧化能力;血脂代謝

隨著人民生活水平的提高以及食品加工業(yè)的日益發(fā)展，人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變，特別是在一些大城市和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，高脂高能膳食的攝入大增。研究表明高脂膳食尤其是飽和脂肪的大量攝入將導(dǎo)致機體肥胖、血脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激［1-4］。而血清總膽固醇(CHO)或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高是發(fā)生冠心病和腦中風(fēng)的重要因素之一［12，16］。目前高脂血癥知曉率、治療率和控制率低［17］，防治高血脂癥，任重而道遠(yuǎn)。槲皮素(quercetin)是具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜水果，酒和茶葉中［18］。槲皮素對人體起著重要的保護(hù)作用，包括抗氧化及清除自由基作用、抗誘變作用、防止DNA氧化損傷、阻止炎癥介質(zhì)的釋放等［19-23］。但槲皮素作為抗氧化劑對高脂日糧小鼠的血脂水平是否有影響尚未見相關(guān)報道，因此本文通過建立高脂動物模型誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激，研究槲皮素對小鼠血脂代謝的影響，并研究了其適宜劑量，為提高居民生命質(zhì)量及槲皮素作為血脂調(diào)節(jié)的功能性食品添加劑提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 w齡雄性昆明種小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

1.2 試劑

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)定量測定試劑盒均購于(神州英諾華公司);總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其余試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素體外抗氧化能力實驗

槲皮素對 DPPH·自由基的清除能力參照Brand-Williams［24］提出的方法測定;對·OH自由基的清除能力用水楊酸法測定［25］;對ABTS+·自由基的清除能力參照Erkan［26］提出的方法測定。

1.3.2 動物實驗的設(shè)計

清潔級雄性昆明種小鼠(體重:20±2 g)32只，飼喂正常日糧1周后，空腹稱重，根據(jù)體重隨機分為4組，即正常對照組(正常日糧)、高脂日糧組(高脂日糧)，槲低組(高脂日糧+0.05 g/kg槲皮素)，槲高組(高脂日糧+0.1 g/kg槲皮素)。正常和高脂日糧組成(表1)

表1 日糧組成(g/100 g)Table 1 Composition of diet(g/100 g)

1.3.3 動物飼養(yǎng)條件

小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由采食和飲水。環(huán)境溫度控制在(23±2℃)，濕度60%，飼養(yǎng)9周。

1.3.4 樣品制備

實驗結(jié)束時禁食12 h，然后乙醚麻醉，摘眼球取血分離血清(4℃，3000 rpm，10 min)，斷頸椎處死小鼠，迅速取肝臟、心臟液氮速凍-70℃保存。10%組織勻漿的制備:準(zhǔn)確稱取0.5 g組織按1∶9(W/V)的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴中用玻璃勻漿器手動勻漿。采用考馬斯亮蘭法測定勻漿液的蛋白質(zhì)含量［8］。

1.4 指標(biāo)的測定

1.4.1 血脂指標(biāo)的檢測

甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的測定均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。動脈粥樣硬化指數(shù)AI=(TG-HDL-C)/HDL-C。

1.4.2 ROS水平的測定

參照luminal化學(xué)發(fā)光法［6，7］測定。

1.4.3 抗氧化指標(biāo)的檢測

總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的測定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果以±s表示，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素體外清除自由基的能力

圖1 槲皮素對DPPH·、·OH和ABTS+·自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activities of quercetin on DPPH·，·OH and ABTS+·radicals

由以上圖以看出槲皮素具有明顯的清除DPPH·，·OH，ABTS+·自由基的作用，而且其清除能力隨濃度的增加而逐漸增強，并呈線性相關(guān)，但增強趨勢逐漸變緩。其中槲皮素對DPPH·自由基的清除能力最強。

2.2 槲皮素對高脂日糧小鼠血清脂質(zhì)的影響

由表2可見，與正常組相比，高脂組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均顯著增高，AI顯著上升，HDLC顯著降低。添加低劑量槲皮素可顯著降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C、AI水平，顯著增大HDL-C含量，而添加高劑量槲皮素對高脂日糧小鼠血清脂質(zhì)紊亂的緩解作用不如低劑量組顯著。

表2 槲皮素對飼高脂日糧小鼠血清脂質(zhì)的影響(n=8)Table 2 Effects of quercetin on serum lipid in mice fed with high-fat diet(n=8)

2.3 槲皮素對高脂日糧小鼠肝臟ROS水平的影響

由表3可見，與正常組相比，高脂組肝臟的ROS水平顯著增高。添加低劑量槲皮素能顯著降低高脂糧小鼠肝臟的ROS水平，而高劑量槲皮素對高脂日糧小鼠肝臟自由基水平清除作用不顯著。

表3 槲皮素對飼高脂日糧小鼠肝臟ROS水平的影響(cd/mg tissue)Table 3 Effects of quercetin on the level of ROS in liver of mice fed with high-fat diet(cd/mg tissue)

2.4 槲皮素對高脂日糧小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，與正常組相比，高脂組小鼠肝臟CAT，GSH-Px，機體總抗氧化能力顯著下降，MDA顯著升高。在高脂日糧基礎(chǔ)上添加低劑量槲皮素可顯著提高小鼠血清的GSH-Px，總抗氧化能力及CAT，M D A顯著下降。而在高脂日糧基礎(chǔ)上添加高劑量槲皮素對提高小鼠血清抗氧化能力不顯著。

表4 槲皮素對飼高脂日糧小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of quercetin on antioxidation capacity in liver of mice fed with high-fat diet

高脂組HFD 0.10±0.02a3.96±0.32a1099.40±393.75a0.34±0.09c高脂+0.05 g/kg槲皮素HFD+0.05 g/kg quercetin 0.28±0.04b5.76±1.37b5693.97±1338.30b0.21±0.02ab高脂+0.1 g/kg槲皮素HFD+0.1 g/kg quercetin 0.13±0.03a3.21±0.55a3893.20±474.26b0.28±0.01bc

2.5 自由基，抗氧化指標(biāo)與血脂的相關(guān)分析

如表5可知MDA與TG、TC、AI呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)。ROS與LDL-C、AI呈正相關(guān)。CAT與LDL-C呈負(fù)相關(guān)。GSH-Px總值與AI呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)。

表5 自由基，抗氧化能力與血脂的相關(guān)性Table 5 The Correlation between free radical，antioxidation capacity and serum lipid

3 討論

高血脂表現(xiàn)為血液中膽固醇和甘油三酯水平明顯提高，是體內(nèi)脂肪代謝紊亂的結(jié)果。高脂高能可引起機體氧化應(yīng)激，生成大量自由基。本實驗通過添加豬油同樣證明了在大量脂肪刺激下，機體產(chǎn)生的自由基水平顯著升高(P＜0.05)。血脂代謝與氧化應(yīng)激之間存在聯(lián)系，本實驗結(jié)果結(jié)合相關(guān)性分析也說明:長期高脂日糧飼喂后，加重了代謝負(fù)擔(dān)，使得脂類的吸收過程中自由基過量積累，機體抗氧化體系平衡被打破，引起機體氧化應(yīng)激，過量的自由基會引起蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)、聚合、肽鏈斷裂等多種損傷，導(dǎo)致血清及組織中的GSH-Px、CAT等抗氧化相關(guān)酶的活性受到顯著的影響，導(dǎo)致T-AOC下降(P＜0.05)，生成大量自由基及MDA［8］。同時，機體的氧化應(yīng)激能夠阻礙線粒體對脂肪酸的利用，使得血液中脂肪酸水平急劇升高，導(dǎo)致脂肪酸調(diào)節(jié)失衡，血脂代謝異常［9］，升高了AI，增加了動脈粥樣硬化的發(fā)生幾率。在治療由于高脂攝入導(dǎo)致的高血脂癥時，從清除和控制機體組織自由基的角度出發(fā)，提高機體抗氧化能力，可緩解氧化應(yīng)激。

GSH-Px和CAT是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶即重要的活性氧自由基清除劑，在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用［10，11］。T-AOC是全面反應(yīng)機體抗氧化能力的指標(biāo)。MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。MDA的高低間接反應(yīng)了機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

本實驗利用高脂飼料建立小鼠高脂血癥模型，結(jié)果顯示，高脂模型組較正常對照組小鼠TC、TG和LDL-C含量顯著增加(P＜0.05)，而HDL-C含量顯著降低(P＜0.05)，表明小鼠高脂模型建立成功。此外，高脂模型組小鼠的肝臟MDA含量較正常對照組顯著增加(P＜0.05)，而CAT、GSH-Px和 TAOC活力顯著降低(P＜0.05)，說明高血脂癥導(dǎo)致小鼠機體氧化一抗氧化狀態(tài)失衡，致使抗氧化劑及細(xì)胞自由基清除酶活力下降以及脂質(zhì)過氧化物含量的增加。

而與高脂模型對照組比較，低劑量槲皮素能顯著改善小鼠的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，并提高肝臟抗氧化酶CAT和GSH-Px的活性，提高TAOC水平，降低MDA含量，表明槲皮素不僅可降低小鼠血脂，提高血液的抗氧化能力，而且還可降低肝臟的脂質(zhì)沉積，可提高肝臟的抗氧化能力，降低動脈硬化指數(shù)，具有潛在的肝臟保護(hù)功能。

本實驗結(jié)果表明槲皮素具有降低血清TC、TG和LDL-C，升高HDL-C的作用。槲皮素能通過抗氧化，清除自由基，其抗氧化活性主要來源于兩個方面，其一，它具有極強保護(hù)和再生 α-生育酚的能力［15］:其二，它具有絡(luò)合過渡金屬離子(比如鐵離子、銅離子等)的能力［13，14］。并升高自由基清除酶CAT，GSH-Px活力，提高機體T-AOC水平，顯著降低脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物MDA的含量，改善高脂血小鼠氧化-抗氧化失衡狀態(tài)，從而減少因高脂血癥產(chǎn)生的過量自由基對機體的損傷作用。

但本實驗同時發(fā)現(xiàn)，高劑量槲皮素的作用效果并不顯著，提示槲皮素對動物的降血脂作用需要一定的劑量，但并非高劑量越高，效果越好。這可能是由于槲皮素具有不同于一般藥物的特殊性，只有在適當(dāng)劑量下，才能表現(xiàn)出最佳的作用效果。當(dāng)其劑量超出一定范圍，過多的槲皮素會通過降低GSH-Px及其還原酶的濃度而轉(zhuǎn)變成促氧化劑［26］。

實驗證明:0.05 g/kg槲皮素的添加量可使高脂日糧小鼠的血脂，肝臟ROS水平及機體抗氧化能力恢復(fù)到接近正常日糧組水平，可認(rèn)為是適宜劑量。

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Effect of Quercetin on Serum Lipid Metabolism of Mice and Its Antioxidant Activity in Vitro

ZHANG Cai-ke，BAI Jing，YU Hui，SHEN Zheng-hua，LE Guo-wei*
State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University; School of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China

This study aimed to investigate the effects of quercetin on scavenging free radicals and serum lipid metabolism of mice fed with high-fat diet.The scavenging activities of quercetin on DPPH·，·OH and ABTS+·radicals were evaluated in vitro，respectively.Thirty-two male Kunming mice(weight:20±2 g)were randomly divided into 4 groups.They were fed with ordinary diet，high-fat diet，high-fat diet plus 0.05 g/kg quercetin and high-fat diet plus 0.1g/kg quercetin，respectively.After 9 weeks，the level of reactive oxygen species(ROS)in liver，contents of malondialdehyde (MDA)and antioxidant enzymes activities in liver and serum lipid level were determined.The results showed that quercetin had strong scavenging efficiencies on DPPH·，·OH and ABTS+· radicals.Moreover，the scavenging capability strengthened with its increasing dosages，although this enhancing trend gradually weakened.0.05 g/kg quercetin could remarkably decrease the level of ROS in liver and the content of MDA，enhance the antioxidant capacity of mice，as well as improve the level of serum lipid while 0.1 g/kg quercetin had no significant effects.The results indicated that 0.05 g/kg quercetin could effectively enhance antioxidant capacity，relieve oxidative stress caused by high-fat diet and improve serum lipid metabolism.

quercetin;high-fat diet;oxidative stress;antioxidant capacity;serum lipid metabolism

R285

A

1001-6880(2012)05-0663-05

2011-10-10 接受日期:2011-12-23

國家科教支撐計劃課題(2012BAD33B05)

*通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn